细胞蛋白NOP53促进单纯疱疹病毒复制的机理研究
发布时间：2021-10-13 11:00
细胞蛋白 NOP53,又称 PICT-1（protein interacting with carboxy1 terminus 1）,由胶质瘤抑制候选基因 2（glioma tumor suppressor candidate region gene 2,GLTSCR2）编码。在多种肿瘤细胞中,NOP53表达下调甚至消失。NOP53上存在多个核定位信号;核糖体应激时,NOP53从细胞核仁易位到核质中。NOP53能够与多种细胞蛋白及病毒蛋白相互作用。本实验室前期研究发现细胞蛋白NOP53能够特异性去除视磺酸诱导基因I（retinoic acid inducible gene-I,RIG-I）K63位泛素化链,从而抑制RIG-I活化,阻断Ⅰ型干扰素的产生。目的意义:本研究从细胞蛋白NOP53的表达与定位入手,研究病毒劫持NOP53以利于自身复制的机制,为揭示病毒-细胞互作机理提供重要的科学资料,同时为设计抗病毒蛋白类广谱抑制剂提供新思路。方法:（1）以单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus1,HSV-1）作为模式病毒,通过RT-PCR、免疫印迹、空斑实验等试验研究过表达...
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：130 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２－１．?ＨｅＬａ细胞中，过表达ＮＯＰ５３促进ＨＳＶ－ｌ／Ｆ复制??在ＨｅＬａ细胞中转染Ｆｌａｇ空载（Ｃｔｒｌ）、Ｆｌａｇ－ＮＯＰ５３?（ＮＯＰ）或Ｆｌａｇ－Ｎ４?（Ｎ４）真核表达质粒３６ｈ后，??
（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ?ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ?ｖｉｒｕｓ，?ＶＳＶ）复制。为了验证?Ｎ４?在?ＨＳＶ－１／Ｆ?复制中的作用，在?ＨｅＬａ?细??胞中转染Ｆｌａｇ－Ｎ４，发现过表达Ｎ４也能够上调ＨＳＶ－ＩＣＰ８?ｍＲＮＡ水平，且在病毒感染６及】２?ｈ??与对照组有显著差异，在病毒感染２４?＾与对照组有极显著差异（如图２－１Ａ）。免疫印迹试验表??明过表达Ｎ４能够上调ＨＳＶ－ＩＣＰ８蛋白水平（如图２－１Ｂ）。最后，如图２－１Ｃ，病毒感染３６ｈ，??过表达Ｎ４组病毒滴度较对照组提升３１倍；病毒感染４８?ｈ，过表达ＮＯＰ５３组病毒滴度较对照??组提升４２倍。上述结果表明，过表达ＮＯＰ５３羧基末端截短体Ｎ４也能够促进ＨＳＶ－丨／Ｆ复制，??且其作用与ＮＯＰ５３全长相当。??２．３．２基因沉默细胞蛋白ＮＯＰ５３对ＩＩＳＶ－１／Ｆ在Ｉｌｅｌａ细胞中复制的影口向??利用小干扰ＲＮＡ技术，研宄ＮＯＰ５３基因沉默对ＨＳＶ－１／Ｆ在Ｈｅｌａ细胞中复制的影响。在??ＨｅＬａ?细胞中转染?ｓｉＮｅｇ?或?ｓｉＮＯＰ５３，?７２?ｈ?后，使用?ＨＳＶ－１／Ｆ?（０．１?ＭＯＩ）感染细胞?３、６、１２、??２４ｈ，提取细胞总ＲＮＡ，进行ＲＴ－ＰＣＲ，检测病毒丨ＣＰ８ｍＲＮＡ水平。如图２－２Ａ，可以发现基??因沉默ＮＯＰ５３可下调ＨＳＶ－ＩＣＰ８?ｍＲＮＡ水平且在病毒感染丨２及２４?ｌｉ与对照组有极显著差异。??在ＨｅＬａ细胞中基因沉默ＮＯＰ５３，使用ＨＳＶ－１／Ｆ?（０．１?ＭＯＩ）感染细胞３６ｈ，提取细胞蛋白进行??免疫印迹试验。如图２－２Ｂ
ＩＦＮ－ｃｃ／ｐ［３Ｓ］）进行试验。在Ｖｅｒｏ细胞中转染Ｆｌａｇ空载体或Ｆｌａｇ－ＮＯＰ５３真核表达质粒，使用??ＨＳＶ－１／Ｆ?（０．１?ＭＯＩ）感染细胞３６或４８丨１。免疫印迹试验结果显示，过表达ＮＯＰ５３能够上调??ＨＳＶ－ＩＣＰ８蛋白水平（如图２－３Ａ）。为了进一步研宄过表达ＮＯＰ５３对ＨＳＶ－１／Ｆ在Ｖｅｒｏ细胞中复??制的影响，使用ＨＳＶ－ｌ／Ｆ?（１?ＭＯＩ）感染过表达Ｆｌａｇ空载或ｎａｇ－ＮＯＰ５３的Ｖｅｒｏ细胞，分别收??集细胞上清（Ｅｘｔｒａｃｅｌｈ丨丨ａｒ）及细胞沉淀（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）中病毒进行空斑实验。发现病毒感染３６??及４８?ｈ，过表达ＮＯＰ５３组上清中病毒滴度较对照组分别提升１４．７倍及１２．６倍（如图２－３Ｂ）。??病毒感染３６及４８?ｈ，过表达ＮＯＰ５３组细胞沉淀中病毒滴度较对照组分别提升丨４．３倍及］３．６??倍（如图２－３Ｃ）。丨：述结果表明，在Ｖｅｒｏ细胞中，过表达ＮＯＰ５３依然能够促进ＨＳＶ－１／Ｆ复制。??另外，在Ｖｅｒｏ细胞中转染Ｆ］ａｇ－Ｎ４进行免疫印迹试验，发现过表达Ｎ４能够上调ＨＳＶ－ＴＣＰ８??蛋白水平（如图２－３Ａ）。病毒感染３６及４８?ｈ，过表达Ｎ４组上清中病毒滴度较对照组分别提升??１０．６倍及丨２．６倍（如图２－３Ｂ）。病毒感染３６及４８?ｈ，过表达Ｎ４组细胞沉淀中病毒滴度较对照??组分别提升８．８倍及８．９倍（如图２－３Ｃ）。上述结果表明
【参考文献】：
期刊论文
[1]Effects of Nigella sativa on outcome of hepatitis C in Egypt[J]. Eman Mahmoud Fathy Barakat,Lamia Mohamed El Wakeel,Radwa Samir Hagag. World Journal of Gastroenterology. 2013(16)
[2]肿瘤抑制基因PTEN的研究进展[J]. 周隽. 癌变.畸变.突变. 2002(02)
博士论文
[1]GLTSCR2负调控Ⅰ型干扰素及抗病毒应答的分子机制[D]. 王鹏.中国农业大学 2017
[2]核仁蛋白PICT-1在核糖体应激下对MDM2-P53信号通路及肿瘤细胞生长的影响及其分子机制[D]. 宋珑.中南大学 2011
本文编号：3434530
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：130 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２－１．?ＨｅＬａ细胞中，过表达ＮＯＰ５３促进ＨＳＶ－ｌ／Ｆ复制??在ＨｅＬａ细胞中转染Ｆｌａｇ空载（Ｃｔｒｌ）、Ｆｌａｇ－ＮＯＰ５３?（ＮＯＰ）或Ｆｌａｇ－Ｎ４?（Ｎ４）真核表达质粒３６ｈ后，??
（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ?ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ?ｖｉｒｕｓ，?ＶＳＶ）复制。为了验证?Ｎ４?在?ＨＳＶ－１／Ｆ?复制中的作用，在?ＨｅＬａ?细??胞中转染Ｆｌａｇ－Ｎ４，发现过表达Ｎ４也能够上调ＨＳＶ－ＩＣＰ８?ｍＲＮＡ水平，且在病毒感染６及】２?ｈ??与对照组有显著差异，在病毒感染２４?＾与对照组有极显著差异（如图２－１Ａ）。免疫印迹试验表??明过表达Ｎ４能够上调ＨＳＶ－ＩＣＰ８蛋白水平（如图２－１Ｂ）。最后，如图２－１Ｃ，病毒感染３６ｈ，??过表达Ｎ４组病毒滴度较对照组提升３１倍；病毒感染４８?ｈ，过表达ＮＯＰ５３组病毒滴度较对照??组提升４２倍。上述结果表明，过表达ＮＯＰ５３羧基末端截短体Ｎ４也能够促进ＨＳＶ－丨／Ｆ复制，??且其作用与ＮＯＰ５３全长相当。??２．３．２基因沉默细胞蛋白ＮＯＰ５３对ＩＩＳＶ－１／Ｆ在Ｉｌｅｌａ细胞中复制的影口向??利用小干扰ＲＮＡ技术，研宄ＮＯＰ５３基因沉默对ＨＳＶ－１／Ｆ在Ｈｅｌａ细胞中复制的影响。在??ＨｅＬａ?细胞中转染?ｓｉＮｅｇ?或?ｓｉＮＯＰ５３，?７２?ｈ?后，使用?ＨＳＶ－１／Ｆ?（０．１?ＭＯＩ）感染细胞?３、６、１２、??２４ｈ，提取细胞总ＲＮＡ，进行ＲＴ－ＰＣＲ，检测病毒丨ＣＰ８ｍＲＮＡ水平。如图２－２Ａ，可以发现基??因沉默ＮＯＰ５３可下调ＨＳＶ－ＩＣＰ８?ｍＲＮＡ水平且在病毒感染丨２及２４?ｌｉ与对照组有极显著差异。??在ＨｅＬａ细胞中基因沉默ＮＯＰ５３，使用ＨＳＶ－１／Ｆ?（０．１?ＭＯＩ）感染细胞３６ｈ，提取细胞蛋白进行??免疫印迹试验。如图２－２Ｂ
ＩＦＮ－ｃｃ／ｐ［３Ｓ］）进行试验。在Ｖｅｒｏ细胞中转染Ｆｌａｇ空载体或Ｆｌａｇ－ＮＯＰ５３真核表达质粒，使用??ＨＳＶ－１／Ｆ?（０．１?ＭＯＩ）感染细胞３６或４８丨１。免疫印迹试验结果显示，过表达ＮＯＰ５３能够上调??ＨＳＶ－ＩＣＰ８蛋白水平（如图２－３Ａ）。为了进一步研宄过表达ＮＯＰ５３对ＨＳＶ－１／Ｆ在Ｖｅｒｏ细胞中复??制的影响，使用ＨＳＶ－ｌ／Ｆ?（１?ＭＯＩ）感染过表达Ｆｌａｇ空载或ｎａｇ－ＮＯＰ５３的Ｖｅｒｏ细胞，分别收??集细胞上清（Ｅｘｔｒａｃｅｌｈ丨丨ａｒ）及细胞沉淀（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）中病毒进行空斑实验。发现病毒感染３６??及４８?ｈ，过表达ＮＯＰ５３组上清中病毒滴度较对照组分别提升１４．７倍及１２．６倍（如图２－３Ｂ）。??病毒感染３６及４８?ｈ，过表达ＮＯＰ５３组细胞沉淀中病毒滴度较对照组分别提升丨４．３倍及］３．６??倍（如图２－３Ｃ）。丨：述结果表明，在Ｖｅｒｏ细胞中，过表达ＮＯＰ５３依然能够促进ＨＳＶ－１／Ｆ复制。??另外，在Ｖｅｒｏ细胞中转染Ｆ］ａｇ－Ｎ４进行免疫印迹试验，发现过表达Ｎ４能够上调ＨＳＶ－ＴＣＰ８??蛋白水平（如图２－３Ａ）。病毒感染３６及４８?ｈ，过表达Ｎ４组上清中病毒滴度较对照组分别提升??１０．６倍及丨２．６倍（如图２－３Ｂ）。病毒感染３６及４８?ｈ，过表达Ｎ４组细胞沉淀中病毒滴度较对照??组分别提升８．８倍及８．９倍（如图２－３Ｃ）。上述结果表明
【参考文献】：
期刊论文
[1]Effects of Nigella sativa on outcome of hepatitis C in Egypt[J]. Eman Mahmoud Fathy Barakat,Lamia Mohamed El Wakeel,Radwa Samir Hagag. World Journal of Gastroenterology. 2013(16)
[2]肿瘤抑制基因PTEN的研究进展[J]. 周隽. 癌变.畸变.突变. 2002(02)
博士论文
[1]GLTSCR2负调控Ⅰ型干扰素及抗病毒应答的分子机制[D]. 王鹏.中国农业大学 2017
[2]核仁蛋白PICT-1在核糖体应激下对MDM2-P53信号通路及肿瘤细胞生长的影响及其分子机制[D]. 宋珑.中南大学 2011
本文编号：3434530
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3434530.html
