猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
发布时间：2021-10-25 23:35
根据GenBank中编码猫杯状病毒（FCV）衣壳蛋白ORF2的保守序列,设计并合成了一对引物和相应的TaqMan探针,建立了快速检测FCV的荧光定量PCR方法.通过对该方法的反应体系和反应条件进行优化,建立了标准曲线,给出了特异性、敏感性和重复性实验,并对临床24份疑似样品（其中阳性3份、阴性21份）进行检测.结果表明:该方法检测cDNA的线性关系为0.992,线性范围为2.26×1011-2.26×101拷贝/μL;可检测出样品中的FCV,其他猫相关病毒检测为阴性;批内重复性实验变异系数为2.158%,与病毒分离结果相符.
【文章来源】：吉林大学学报(理学版). 2013,51(05)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
引物和探针浓度的优化
双蒸馏水进行荧光定量PCR检测，结果如图3所示．由图3可见，仅FCV产生荧光信号，呈现良好的特异性．图2实时荧光定量PCR方法的标准曲线Fig．2StandardcurveofrealtimePCR图3特异性实验结果Fig．3Testofspecificity2．4敏感性实验结果将计算出拷贝数的质粒做10倍系列稀释，进行荧光定量PCR实验，结果如图4所示．由图4可见，荧光定量PCR检测到的最低浓度为2．26×101拷贝/μL，表明该方法具有较高的灵敏度．2．5重复性实验结果对阳性样品进行4次重复检测，结果如图5所示．通过统计分析可得变异系数为2．158%，表明该方法具有较好的准确性和重现性．图4敏感性实验结果Fig．4Testofsensibility图5重复性实验结果Fig．5Curvesofrepeattest2．6疑似临床样品的检测及病毒分离鉴定结果M:DL2000分子量标准;1，2，3:PCR产物;4:阴性对照．图6RT-PCR结果Fig．6ResultofRT-PCR用优化后的荧光定量PCR方法对24份疑似患FCV病猫的唾液样品进行检测，结果为阳性样本3份，阴性样本21份，FCV的检出率为12．5%．采用F81细胞从荧光定量PCR阳性样本中分离病毒，3d后，细胞均出现圆缩、葡萄串样和细胞脱落等病变．采用普通RT-PCR鉴定细胞培养物，结果均获得预期核苷酸片段，如图6所示．因此，本文建立的荧光定量PCR方法可较敏感地检测出阳性样本．综上可见，本文建立的FCV荧光定量PCR方法，检测标准品的线性关系为0．992，最低检测为2．26×101拷贝/μL，具有较高的敏感性;特异性实验结果表明，该方法仅能检测FCV，无法检测其他相关病毒，呈现出良好的特异性;重复性实验表明，批内变异系数为2．158%，重复性较好;临床疑似样品的检测率为12．5%，与文献［17］结果相符．976吉林大学学报(理学版)第51卷
双蒸馏水进行荧光定量PCR检测，结果如图3所示．由图3可见，仅FCV产生荧光信号，呈现良好的特异性．图2实时荧光定量PCR方法的标准曲线Fig．2StandardcurveofrealtimePCR图3特异性实验结果Fig．3Testofspecificity2．4敏感性实验结果将计算出拷贝数的质粒做10倍系列稀释，进行荧光定量PCR实验，结果如图4所示．由图4可见，荧光定量PCR检测到的最低浓度为2．26×101拷贝/μL，表明该方法具有较高的灵敏度．2．5重复性实验结果对阳性样品进行4次重复检测，结果如图5所示．通过统计分析可得变异系数为2．158%，表明该方法具有较好的准确性和重现性．图4敏感性实验结果Fig．4Testofsensibility图5重复性实验结果Fig．5Curvesofrepeattest2．6疑似临床样品的检测及病毒分离鉴定结果M:DL2000分子量标准;1，2，3:PCR产物;4:阴性对照．图6RT-PCR结果Fig．6ResultofRT-PCR用优化后的荧光定量PCR方法对24份疑似患FCV病猫的唾液样品进行检测，结果为阳性样本3份，阴性样本21份，FCV的检出率为12．5%．采用F81细胞从荧光定量PCR阳性样本中分离病毒，3d后，细胞均出现圆缩、葡萄串样和细胞脱落等病变．采用普通RT-PCR鉴定细胞培养物，结果均获得预期核苷酸片段，如图6所示．因此，本文建立的荧光定量PCR方法可较敏感地检测出阳性样本．综上可见，本文建立的FCV荧光定量PCR方法，检测标准品的线性关系为0．992，最低检测为2．26×101拷贝/μL，具有较高的敏感性;特异性实验结果表明，该方法仅能检测FCV，无法检测其他相关病毒，呈现出良好的特异性;重复性实验表明，批内变异系数为2．158%，重复性较好;临床疑似样品的检测率为12．5%，与文献［17］结果相符．976吉林大学学报(理学版)第51卷
【参考文献】：
期刊论文
[1]实时荧光定量PCR检测猪病料中的PRRSV与CSFV[J]. 陈钟鸣,张志成,方光远. 动物医学进展. 2011(02)
[2]CSFV和PRRSV二联RT-PCR检测方法的建立[J]. 王开,裴志花,李菲. 吉林农业大学学报. 2011(01)
[3]实时荧光定量PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒[J]. 牛伟,丁壮,王晓莉,宋德武,宣华,母连志,李国江. 中国兽医学报. 2011(02)
[4]牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 范晴,谢芝勋,刘加波,庞耀珊,邓显文,谢志勤,谢丽基,彭宜. 动物医学进展. 2010(10)
[5]猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立[J]. 张春明,乔传玲,陈艳,杨焕良,辛晓光,陈化兰,冉多良. 中国预防兽医学报. 2008(10)
[6]实时定量PCR技术及其应用[J]. 王梁燕,洪奇华,张耀洲. 细胞生物学杂志. 2004(01)
本文编号：3458383
【文章来源】：吉林大学学报(理学版). 2013,51(05)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
引物和探针浓度的优化
双蒸馏水进行荧光定量PCR检测，结果如图3所示．由图3可见，仅FCV产生荧光信号，呈现良好的特异性．图2实时荧光定量PCR方法的标准曲线Fig．2StandardcurveofrealtimePCR图3特异性实验结果Fig．3Testofspecificity2．4敏感性实验结果将计算出拷贝数的质粒做10倍系列稀释，进行荧光定量PCR实验，结果如图4所示．由图4可见，荧光定量PCR检测到的最低浓度为2．26×101拷贝/μL，表明该方法具有较高的灵敏度．2．5重复性实验结果对阳性样品进行4次重复检测，结果如图5所示．通过统计分析可得变异系数为2．158%，表明该方法具有较好的准确性和重现性．图4敏感性实验结果Fig．4Testofsensibility图5重复性实验结果Fig．5Curvesofrepeattest2．6疑似临床样品的检测及病毒分离鉴定结果M:DL2000分子量标准;1，2，3:PCR产物;4:阴性对照．图6RT-PCR结果Fig．6ResultofRT-PCR用优化后的荧光定量PCR方法对24份疑似患FCV病猫的唾液样品进行检测，结果为阳性样本3份，阴性样本21份，FCV的检出率为12．5%．采用F81细胞从荧光定量PCR阳性样本中分离病毒，3d后，细胞均出现圆缩、葡萄串样和细胞脱落等病变．采用普通RT-PCR鉴定细胞培养物，结果均获得预期核苷酸片段，如图6所示．因此，本文建立的荧光定量PCR方法可较敏感地检测出阳性样本．综上可见，本文建立的FCV荧光定量PCR方法，检测标准品的线性关系为0．992，最低检测为2．26×101拷贝/μL，具有较高的敏感性;特异性实验结果表明，该方法仅能检测FCV，无法检测其他相关病毒，呈现出良好的特异性;重复性实验表明，批内变异系数为2．158%，重复性较好;临床疑似样品的检测率为12．5%，与文献［17］结果相符．976吉林大学学报(理学版)第51卷
双蒸馏水进行荧光定量PCR检测，结果如图3所示．由图3可见，仅FCV产生荧光信号，呈现良好的特异性．图2实时荧光定量PCR方法的标准曲线Fig．2StandardcurveofrealtimePCR图3特异性实验结果Fig．3Testofspecificity2．4敏感性实验结果将计算出拷贝数的质粒做10倍系列稀释，进行荧光定量PCR实验，结果如图4所示．由图4可见，荧光定量PCR检测到的最低浓度为2．26×101拷贝/μL，表明该方法具有较高的灵敏度．2．5重复性实验结果对阳性样品进行4次重复检测，结果如图5所示．通过统计分析可得变异系数为2．158%，表明该方法具有较好的准确性和重现性．图4敏感性实验结果Fig．4Testofsensibility图5重复性实验结果Fig．5Curvesofrepeattest2．6疑似临床样品的检测及病毒分离鉴定结果M:DL2000分子量标准;1，2，3:PCR产物;4:阴性对照．图6RT-PCR结果Fig．6ResultofRT-PCR用优化后的荧光定量PCR方法对24份疑似患FCV病猫的唾液样品进行检测，结果为阳性样本3份，阴性样本21份，FCV的检出率为12．5%．采用F81细胞从荧光定量PCR阳性样本中分离病毒，3d后，细胞均出现圆缩、葡萄串样和细胞脱落等病变．采用普通RT-PCR鉴定细胞培养物，结果均获得预期核苷酸片段，如图6所示．因此，本文建立的荧光定量PCR方法可较敏感地检测出阳性样本．综上可见，本文建立的FCV荧光定量PCR方法，检测标准品的线性关系为0．992，最低检测为2．26×101拷贝/μL，具有较高的敏感性;特异性实验结果表明，该方法仅能检测FCV，无法检测其他相关病毒，呈现出良好的特异性;重复性实验表明，批内变异系数为2．158%，重复性较好;临床疑似样品的检测率为12．5%，与文献［17］结果相符．976吉林大学学报(理学版)第51卷
【参考文献】：
期刊论文
[1]实时荧光定量PCR检测猪病料中的PRRSV与CSFV[J]. 陈钟鸣,张志成,方光远. 动物医学进展. 2011(02)
[2]CSFV和PRRSV二联RT-PCR检测方法的建立[J]. 王开,裴志花,李菲. 吉林农业大学学报. 2011(01)
[3]实时荧光定量PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒[J]. 牛伟,丁壮,王晓莉,宋德武,宣华,母连志,李国江. 中国兽医学报. 2011(02)
[4]牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 范晴,谢芝勋,刘加波,庞耀珊,邓显文,谢志勤,谢丽基,彭宜. 动物医学进展. 2010(10)
[5]猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立[J]. 张春明,乔传玲,陈艳,杨焕良,辛晓光,陈化兰,冉多良. 中国预防兽医学报. 2008(10)
[6]实时定量PCR技术及其应用[J]. 王梁燕,洪奇华,张耀洲. 细胞生物学杂志. 2004(01)
本文编号：3458383
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