一种用于A型鸭甲肝病毒检测的类病毒颗粒制备

发布时间：2021-10-28 06:56

　　鸭病毒性肝炎（Duck Viral Hepatitis, DVH）是雏鸭的一种急性致死性疾病,以肝炎和高死亡率为主要特征,病原是鸭肝炎病毒（Duck Hepatitis Virus, DHV）。我国流行的鸭肝炎以A型鸭甲肝病毒（Duck Hepatitis A Virus, DHAV-1）为主。DHAV-1由于个体很小,纯化较为困难。通过杆状病毒表达系统制备DHAV-1类病毒颗粒（virus-like particle, VLP）,可以更方便的获得病毒人工抗原,通过纯化,可将其用于DHAV-1的检测,以辅助该病的预防和控制工作,亦可作为潜在的候选疫苗或以此为抗原制备单克隆抗体建立免疫学诊断方法奠定基础。小RNA病毒（Picornavirus）病毒衣壳具有相似的组装模式,以3CD蛋白水解酶将P1结构蛋白前蛋白切割成单一的结构蛋白再组装而成。本实验根据DHV-1JX株基因组序列,设计含有BamH Ⅰ和Sai Ⅰ酶切位点的P1基因引物,含有Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点的3CD基因引物,以JX株RNA为模板,RT-PCR扩增P1和3CD基因。随后运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将D... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
    1 DHAV概述
        1.1 DHAV的流行现状
        1.2 DHAV-1的分类地位
        1.3 DHAV的病原学特性
        1.4 DHAV的纯化
        1.5 DHAV病原检测
    2 类病毒颗粒的研究概述
        2.1 小RNA病毒VLP组装研究
        2.2 VLP的应用
    3 杆状病毒表达系统
    4 本研究的目的与意义
第二章 重组杆状病毒vBac-P1-3CD的获得及DHAV-1病毒样颗粒的表达
    1 实验材料
        1.1 毒株、菌株、质粒及细胞
        1.2 主要试剂
        1.3 培养基
    2 试验方法
        2.1 P1、3CD基因的引物设计与合成
        2.2 P1和3CD基因的克隆
            2.2.1 病毒RNA的提取
            2.2.2 RT-PCR扩增及检测
            2.2.3 RT-PCR产物回收与纯化
            2.2.4 RT-PCR产物与pMD18-T载体的连接
            2.2.5 E.coli DH5α感受态细胞的制备
            2.2.6 连接产物的转化
            2.2.7 质粒DNA的提取
            2.2.8 重组质粒的鉴定
            2.2.9 序列比对
        2.3 构建供体质粒pFastBac Dual-P1-3CD
            2.3.1 P1基因和pFastBac Dual质粒双酶切
            2.3.2 P1与pFastBac Dual质粒的酶切产物的连接、转化及鉴定
            2.3.3 3CD基因和pFastBac Dual-P1质粒双酶切
            2.3.4 3CD基因与pFastBac Dual-P1质粒的酶切产物的连接、转化及鉴定
        2.4 构建穿梭质粒Bacmid-P1-3CD
            2.4.1 制备DH10感受态细胞
            2.4.2 pFastBac Dual-P1-3CD质粒转化DH10感受态细胞
            2.4.3 重组杆状质粒DNA的提取
            2.4.4 重组杆状质粒的鉴定
        2.5 重组杆状病毒vBac-P1-3CD的获得
            2.5.1 重组杆状质粒转染昆虫细胞Sf-9
            2.5.2 感染Sf-9细胞收获重组杆状病毒
        2.6 DHAV-1类病毒颗粒的鉴定
            2.6.1 病毒滴度的测定
            2.6.2 病毒感染Sf-9细胞
            2.6.3 电镜观察细胞内类病毒颗粒
            2.6.4 Western blot检测目的基因
            2.6.5 类病毒颗粒的初步纯化
            2.6.6 类病毒颗粒负染电镜观察
    3 试验结果
        3.1 P1、3CD基因的克隆
        3.2 pFastBac Dual-P1-3CD质粒的构建
        3.3 穿梭质粒Bacmid-P1-3CD的构建
        3.4 重组杆状病毒的获得
        3.5 感染细胞的超薄切片观察
        3.6 重组蛋白的表达
        3.7 DHAV-1 VLP的纯化及观察
    4 讨论
        4.1 重组杆状病毒的构建
        4.2 VLP的形成及特性分析
    5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Ⅰ型鸭肝炎病毒概述[J]. 范卫国,杜佳慧,曹瑞兵,陈溥言.  动物医学进展. 2009(11)
[2]Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立[J]. 黄显明,张小飞,李春芬,廖俊伟,毛火云.  中国兽医科学. 2008(01)
[3]Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J]. 程安春,汪铭书,信洪一,陈海军,杨苗,郭宇飞,朱德康,贾仁勇,袁桂萍,陈孝跃.  中国兽医科学. 2007(01)
[4]Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J]. 马秀丽,宋敏训,黄兵,廖明,辛朝安.  家禽科学. 2006(11)
[5]Ⅱ型鸭肝炎病毒变异株的鉴定[J]. 郑献进,张大丙,曲丰发,丁春宇.  中国兽医杂志. 2006(05)
[6]鸭肝炎病毒单克隆抗体的研制[J]. 杨萍萍,宋敏训,艾武,马秀丽,崔言顺.  中国预防兽医学报. 2006(02)
[7]Expression,purification and characterization of enterovirus-71 virus-like particles[J]. Yao-Chi Chung Jen-Huang Huang Chia-Wei Lai Heng-Chun Sheng Yu-Chen Hu,Department of Chemical Engineering,National Tsing Hua University,Hsinchu 300,Taiwan,ChinaShin-Ru Shih,School of Medical Technology,Chang Gung University,Taoyuan 333.Taiwan,ChinaMei-Shang Ho,Institute of Biomedical Sciences,Academia Sinica.Taipei 11529.Taiwan.China.  World Journal of Gastroenterology. 2006(06)
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[9]鸭病毒性肝炎病毒的分离鉴定[J]. 沈国顺,刘丽霞.  畜牧与兽医. 2004(02)
[10]单克隆抗体PAP法对实验感染雏鸭体内鸭肝炎病毒的定位检测[J]. 程国富,周诗其,熊道焕,胡薛英.  河南畜牧兽医. 1998(01)

硕士论文
[1]鸭病毒性肝炎病毒分离与鉴定及其RT-PCR快速诊断方法的建立[D]. 蒙秋.广西大学 2007
[2]鸭肝炎病毒（DHV-1）的纯化及结构蛋白分析[D]. 胡燕宾.西南大学 2007



本文编号：3462441