CRISPR/Cas系统及其在结核分枝杆菌研究中的应用
发布时间：2021-11-09 03:01
簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统是一种针对入侵核酸的可遗传性原核适应性免疫系统。CRISPR/Cas系统可以产生高度特异性的基因双链断裂,并通过非同源末端连接（NHEJ）或者同源重组（HR）进行修复,如今已经成为许多生物方便有效的基因组编辑工具。结核分枝杆菌因其基因操作的复杂性,其基因组研究存在诸多困难,因此,CRISPR/Cas系统的出现对结核分枝杆菌的研究具有里程碑式意义。本文围绕CRISPR/Cas系统在结核分枝杆菌中的应用,综述了国内外最新的研究进展,为结核分枝杆菌研究方法的选择提供参考。
【文章来源】：畜牧兽医学报. 2020,51(11)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
CRISPR 免疫的3个阶段[16]
Ⅱ型CRISPR-Cas系统是最常用的基因组编辑工具,Ⅱ型CRISPR-Cas系统的Cas9蛋白可以通过两个核酸裂解域(RuvC和HNH),裂解靶DNA链并产生双链断裂(DSB)[9],从而进行基因编辑。CRISPR干扰(CRISPRi)系统是通过使用核酸内切酶缺陷型Cas9(又称dCas9)开发的一种改良的CRISPR系统,其通过人为在Cas9每个结构域(分别是D10A和H840A)中引入点突变,突变后的Cas9蛋白不具备裂解活性,但不影响其与靶基因的结合,可以通过sgRNA引导至靶基因,达到靶向基因调控的作用,该系统可以将基因表达抑制数千倍以上[42]。该系统与RNAi有显著的不同,RNAi的基因调控需要在翻译之前破坏已转录的信使RNA,而CRISPRi可以利用RNA直接阻断转录。2015年,由Choudhary等[43]首次将CRISPRi应用在结核分枝杆菌中,通过引入化脓性链球菌(革兰阳性菌)的dCas9,并使用ATc诱导型启动子来实现结核分枝杆菌靶基因的受控表达。2016年,Singh等[5]在Choudhary等的研究基础上进一步验证了该系统对结核分枝杆菌必需基因的抑制作用,并证明了CRISPRi对结核分枝杆菌基因组的显著抑制作用。2017年,Rock等[44]筛选了11种不同来源的Cas9蛋白,发现嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的dCas9 Sth1最为有效,且蛋白毒性最小。加入小分子诱导剂脱水四环素或强力霉素可诱导Sth1 dCas9和sgRNA表达,从而导致靶基因的转录沉默,这种CRISPRi系统为结核基因组(图3)[6],尤其是针对不能被传统基于重组的基因编辑工具操作的必需基因的研究提供了简单、快速、高效的工具,这也为快速寻找结核药物靶点、开发新型抗结核药物提供了可能[6],并且该系统被证明可以同时抑制多个靶基因,这对于生长缓慢的结核分枝杆菌具有重要意义。目前,这种新型的CRISPRi系统已经在结核分枝杆菌的基因组研究领域得到应用[45-46]。2.3 结核分枝杆菌的核酸检测
基因分型是表征结核分枝杆菌的细菌进化和系统发育的重要手段[49],可以更好地了解病原体特定的传播和发病机制。CRISPR序列是由一段交替的同向DNA重复序列(DRs)和可变的间隔序列组成。在CRISPR序列中,同向DNA重复序列的大小和顺序几乎没有差别,但间隔序列在不同致病菌、相同致病菌的不同血清型和不同菌株之间差异很大,所以从数量和性质上分析 CRISPR 间隔区的结构可以进行有效的基因分型[50]。因为结核分枝杆菌复合体(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)成员基因组中CRISPR结构的存在,Kamerbeek等[51]开发了间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucletide typing,Spoligotyping),这种方法基于体外扩增的DNA与多个间隔寡核苷酸的应变依赖性杂交模式,对由保守DR隔开的43个寡核苷酸间隔子进行分析,该方法具有高度可重复性,已发展成为大型分子流行病学项目的高通量检测方法,被广泛用于结核分枝杆菌的分型等相关研究中[52-54],同时也已经被应用到其他生物中[55-56]。当前有两种方法用于获取spoligotype。第1种方法(原始方法)基于反向杂交,将PCR产物与含有合成寡核苷酸的膜上杂交,该合成寡核苷酸具有与间隔序列互补的序列,使其中每个间隔子的序列均附着在膜上的特定区域[57],当PCR产物与特定寡核苷酸序列未产生标记,则表明在所检查的菌株中不存在相应的间隔区序列。第2种方法基于Luminex技术(Luminex technology),其中,每个间隔寡核苷酸通过共价连接至微球,使用微球用作捕获探针,同时每个微球上还包含两个共价连接的荧光染料,一束激光将激发荧光染料以识别间隔子,第二激光将激发结合到含有间隔子的PCR产物的报道分子上[55]。图4 CRISPR-MTB方案[48]
本文编号：3484493
【文章来源】：畜牧兽医学报. 2020,51(11)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
CRISPR 免疫的3个阶段[16]
Ⅱ型CRISPR-Cas系统是最常用的基因组编辑工具,Ⅱ型CRISPR-Cas系统的Cas9蛋白可以通过两个核酸裂解域(RuvC和HNH),裂解靶DNA链并产生双链断裂(DSB)[9],从而进行基因编辑。CRISPR干扰(CRISPRi)系统是通过使用核酸内切酶缺陷型Cas9(又称dCas9)开发的一种改良的CRISPR系统,其通过人为在Cas9每个结构域(分别是D10A和H840A)中引入点突变,突变后的Cas9蛋白不具备裂解活性,但不影响其与靶基因的结合,可以通过sgRNA引导至靶基因,达到靶向基因调控的作用,该系统可以将基因表达抑制数千倍以上[42]。该系统与RNAi有显著的不同,RNAi的基因调控需要在翻译之前破坏已转录的信使RNA,而CRISPRi可以利用RNA直接阻断转录。2015年,由Choudhary等[43]首次将CRISPRi应用在结核分枝杆菌中,通过引入化脓性链球菌(革兰阳性菌)的dCas9,并使用ATc诱导型启动子来实现结核分枝杆菌靶基因的受控表达。2016年,Singh等[5]在Choudhary等的研究基础上进一步验证了该系统对结核分枝杆菌必需基因的抑制作用,并证明了CRISPRi对结核分枝杆菌基因组的显著抑制作用。2017年,Rock等[44]筛选了11种不同来源的Cas9蛋白,发现嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的dCas9 Sth1最为有效,且蛋白毒性最小。加入小分子诱导剂脱水四环素或强力霉素可诱导Sth1 dCas9和sgRNA表达,从而导致靶基因的转录沉默,这种CRISPRi系统为结核基因组(图3)[6],尤其是针对不能被传统基于重组的基因编辑工具操作的必需基因的研究提供了简单、快速、高效的工具,这也为快速寻找结核药物靶点、开发新型抗结核药物提供了可能[6],并且该系统被证明可以同时抑制多个靶基因,这对于生长缓慢的结核分枝杆菌具有重要意义。目前,这种新型的CRISPRi系统已经在结核分枝杆菌的基因组研究领域得到应用[45-46]。2.3 结核分枝杆菌的核酸检测
基因分型是表征结核分枝杆菌的细菌进化和系统发育的重要手段[49],可以更好地了解病原体特定的传播和发病机制。CRISPR序列是由一段交替的同向DNA重复序列(DRs)和可变的间隔序列组成。在CRISPR序列中,同向DNA重复序列的大小和顺序几乎没有差别,但间隔序列在不同致病菌、相同致病菌的不同血清型和不同菌株之间差异很大,所以从数量和性质上分析 CRISPR 间隔区的结构可以进行有效的基因分型[50]。因为结核分枝杆菌复合体(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)成员基因组中CRISPR结构的存在,Kamerbeek等[51]开发了间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucletide typing,Spoligotyping),这种方法基于体外扩增的DNA与多个间隔寡核苷酸的应变依赖性杂交模式,对由保守DR隔开的43个寡核苷酸间隔子进行分析,该方法具有高度可重复性,已发展成为大型分子流行病学项目的高通量检测方法,被广泛用于结核分枝杆菌的分型等相关研究中[52-54],同时也已经被应用到其他生物中[55-56]。当前有两种方法用于获取spoligotype。第1种方法(原始方法)基于反向杂交,将PCR产物与含有合成寡核苷酸的膜上杂交,该合成寡核苷酸具有与间隔序列互补的序列,使其中每个间隔子的序列均附着在膜上的特定区域[57],当PCR产物与特定寡核苷酸序列未产生标记,则表明在所检查的菌株中不存在相应的间隔区序列。第2种方法基于Luminex技术(Luminex technology),其中,每个间隔寡核苷酸通过共价连接至微球,使用微球用作捕获探针,同时每个微球上还包含两个共价连接的荧光染料,一束激光将激发荧光染料以识别间隔子,第二激光将激发结合到含有间隔子的PCR产物的报道分子上[55]。图4 CRISPR-MTB方案[48]
本文编号：3484493
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