紧密连接蛋白Occludin影响牛病毒性腹泻病毒感染
发布时间：2021-12-11 01:32
为了研究紧密连接蛋白Occludin（OCLN）在调控牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）胞内复制中的重要作用。使用Benchling平台设计OCLN的向导RNA（short guide RNA,sgRNA）序列,克隆至LentiCRISPR V2质粒中,包装慢病毒后感染牛肾细胞（madin-darby bovine kidney,MDBK）,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,使用Western blot检测OCLN敲除情况,建立OCLN敲除MDBK细胞系;于BVDV感染OCLN KO细胞不同时间,使用荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和免疫荧光染色（immunofluorescence,IF）检测BVDV 5’非编码区（untranslated region,UTR）mRNA和双链RNA（double strand RNA,dsRNA）水平;使用Reed-Muench法测定BVDV感染OCLN KO细胞不同时间后病毒滴度;使用倒置显微镜观察BVD...
【文章来源】：中国兽医学报. 2020,40(11)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
酶切LentiCRISPR v2载体
共同转染慢病毒质粒及包装辅助质粒后收集慢病毒,感染靶细胞后使用嘌呤霉素进行筛选,获得阳性细胞。plenti-GFP-N2慢病毒作为荧光阳性对照,如图2所示,plenti-GFP-N2慢病毒感染MDBK,使用嘌呤霉素筛选5代后,荧光细胞密度达90%以上,表明慢病毒感染性较好,其方法可用于其他慢病毒的包装、感染和阳性细胞筛选。2.3 Western blot鉴定OCLN KO细胞
于BVDV感染后0,3,6,12,24和48 h时收集细胞和培养液,提取总RNA并反转录成cDNA,使用qRT-PCR检测BVDV 5′UTR mRNA水平。结果如图4A所示,与Scramble对照组相比,BVDV感染OCLN KO细胞0,3,6 h后 5′UTR mRNA水平显著性降低,表明OCLN敲除在BVDV侵入宿主细胞等早期阶段。如图4B所示,与Scramble对照组相比,BVDV感染OCLN KO细胞12,24,48 h时5′UTR mRNA水平显著性下降,表明OCLN敲除影响BVDV mRNA复制。结果表明,OCLN敲除阻碍BVDV侵入细胞,导致BVDV初始感染量显著性降低,造成BVDV mRNA复制明显下降。图4 qRT-PCR检测BVDV 5′UTR mRNA水平
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛病毒性腹泻疫苗的研究进展[J]. 李世芳,龚美娇,邵军军,常惠芸. 中国兽医学报. 2018(04)
本文编号：3533765
【文章来源】：中国兽医学报. 2020,40(11)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
酶切LentiCRISPR v2载体
共同转染慢病毒质粒及包装辅助质粒后收集慢病毒,感染靶细胞后使用嘌呤霉素进行筛选,获得阳性细胞。plenti-GFP-N2慢病毒作为荧光阳性对照,如图2所示,plenti-GFP-N2慢病毒感染MDBK,使用嘌呤霉素筛选5代后,荧光细胞密度达90%以上,表明慢病毒感染性较好,其方法可用于其他慢病毒的包装、感染和阳性细胞筛选。2.3 Western blot鉴定OCLN KO细胞
于BVDV感染后0,3,6,12,24和48 h时收集细胞和培养液,提取总RNA并反转录成cDNA,使用qRT-PCR检测BVDV 5′UTR mRNA水平。结果如图4A所示,与Scramble对照组相比,BVDV感染OCLN KO细胞0,3,6 h后 5′UTR mRNA水平显著性降低,表明OCLN敲除在BVDV侵入宿主细胞等早期阶段。如图4B所示,与Scramble对照组相比,BVDV感染OCLN KO细胞12,24,48 h时5′UTR mRNA水平显著性下降,表明OCLN敲除影响BVDV mRNA复制。结果表明,OCLN敲除阻碍BVDV侵入细胞,导致BVDV初始感染量显著性降低,造成BVDV mRNA复制明显下降。图4 qRT-PCR检测BVDV 5′UTR mRNA水平
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛病毒性腹泻疫苗的研究进展[J]. 李世芳,龚美娇,邵军军,常惠芸. 中国兽医学报. 2018(04)
本文编号：3533765
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