VP1蛋白影响鸡传染性法氏囊病毒致病性的分子机制
发布时间：2021-12-19 00:46
鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是由鸡传染性法囊病病毒（Infectious bursaldisease virus, IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病。IBD是危害世界养禽业最严重的疾病之一。除经典毒株外，具有致病性的血清I型毒株目前还包括弱毒株、抗原变异毒株和超强毒株（very virulent Infectious bursal disease virus, vvIBDV）。IBDV各型毒株致病性不尽相同，特别是1987年vvIBDV的出现给IBD的防控带来了新的挑战。vvIBDV的高致死率给养禽业造成了严重的损失。探索各型毒株致病性差异的分子基础及分子机制一直是IBDV研究的热点之一。IBDV基因功能及致病机制的早期研究主要聚焦在基因组A节段及其编码的VP2蛋白。近来的流行病学数据显示，基因组B节段及其编码的VP1蛋白与vvIBDV的爆发关系密切。本研究将进一步证实B节段及其编码的VP1蛋白与IBDV致病性增强的关系，定位其具体分子基础，并从病毒自身和宿主因子两个角度探讨其分子机制。 克隆获得HuB-1、HeB10XS02...
【文章来源】： 中国农业科学院北京市
【文章页数】：127 页
【文章目录】：
博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表
摘要
Abstract
图表目录
英文缩略表
第一章 引言
1.1 IBD 概况
1.1.1 IBD 的流行特点
1.1.2 IBD 的防制
1.2 IBDV 的结构和分子生物学
1.2.1 IBDV 的形态学及血清型分类
1.2.2 IBDV 的基因组和编码蛋白
1.3 IBDV 的拯救系统
1.3.1 体外转录拯救系统
1.3.2 基于 T7 RNA 聚合酶的体内转录拯救系统
1.3.3 RNA 聚合酶 II 表达拯救系统
1.3.4 vvIBDV 的拯救
1.4 IBDV 的研究进展
1.4.1 关于 IBDV A 节段的研究
1.4.2 关于 IBDV B 节段的研究
1.5 问题与展望
1.6 本研究的目的及意义
第二章 IBDV 全基因组的克隆与序列分析
2.1 材料与方法
2.1.1 病毒、鸡胚及实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 引物设计及合成
2.1.4 病毒复状
2.1.5 鸡胚半数致死量（ELD50）的测定
2.1.6 SPF 鸡致死率的测定
2.1.7 IBDV 全基因组 RNA 的提取
2.1.8 IBDV 全基因组 RNA 的反转录
2.1.9 IBDV 全基因组克隆
2.1.10 IBDV 全基因组遗传演化分析
2.2 结果
2.2.1 ELD50及 SPF 鸡致死率的测定
2.2.2 IBDV 全基因组扩增及测序
2.2.3 IBDV 全基因组遗传演化分析
2.2.4 VP1 编码氨基酸序列比对
2.3 讨论
第三章 不同亚群 VP1 蛋白对 IBDV 致病性作用研究
3.1 材料和方法
3.1.1 质粒、细胞和单克隆抗体
3.1.2 主要试剂
3.1.3 引物设计与合成
3.1.4 核酶结构的引入
3.1.5 全基因组真核表达质粒的构建
3.1.6 病毒拯救
3.1.7 拯救病毒 IFA 检测
3.1.8 拯救病毒电镜观察
3.1.9 拯救病毒 RT-PCR 鉴定
3.1.10 拯救细胞适应病毒体外复制动力学研究
3.1.11 拯救细胞非适应病毒 ELD50的测定
3.1.12 拯救病毒致病性研究
3.2 结果
3.2.1 感染性克隆的构建
3.2.2 细胞适应病毒的拯救与鉴定
3.2.3 细胞非适应病毒的拯救与鉴定
3.2.4 细胞适应病毒体外复制动力学研究
3.2.5 拯救重组细胞非适应病毒 ELD50的测定
3.2.6 试验鸡症状及剖检变化
3.2.7 重组病毒体内复制动力学研究
3.2.8 试验鸡的囊重比及囊指数
3.2.9 试验鸡法氏囊的组织病理学变化
3.2.10 细胞非适应病毒对 SPF 鸡的致死率
3.3 讨论
3.3.1 VP1 蛋白影响 IBDV 的复制及致病性
3.3.2 A 节段在 IBDV 的复制及致病性方面仍扮演重要角色
第四章 VP1 N 端 145-147 位氨基酸影响 IBDV 的致病性
4.1 材料和方法
4.1.1 质粒、细胞和单克隆抗体
4.1.2 主要试剂
4.1.3 引物设计与合成
4.1.4 IBDV VP1 N 端氨基酸序列比对
4.1.5 感染性克隆的构建
4.1.6 病毒拯救
4.1.7 细胞适应毒 IFA 检测
4.1.8 拯救病毒电镜观察
4.1.9 拯救病毒 RT-PCR 鉴定
4.1.10 细胞适应病毒体外复制动力学研究
4.1.11 细胞非适应病毒 ELD50的测定
4.1.12 病毒致病性研究
4.1.13 minigenome 质粒的构建
4.1.14 VP1 聚合酶活性的检测
4.2 结果
4.2.1 IBDV VP1 N 端氨基酸序列比对
4.2.2 感染性克隆的构建
4.2.3 细胞适应病毒的鉴定
4.2.4 细胞非适应病毒的鉴定
4.2.5 细胞适应病毒体外复制动力学研究
4.2.6 细胞非适应病毒 ELD50的测定
4.2.7 试验鸡症状及剖检变化
4.2.8 重组病毒体内复制动力学研究
4.2.9 试验鸡的囊重比及囊指数
4.2.10 试验鸡法氏囊的组织病理学变化
4.2.11 细胞非适应病毒对 SPF 鸡的致死率
4.2.12 VP1 聚合酶活性的检测
4.3 讨论
4.3.1 VP1 N 端 145-147 位氨基酸存在 3 种独特的基序
4.3.2 VP1 N 端 145-147 位氨基酸影响 IBDV 的致病性
4.3.3 VP1 N 端 145-147 位氨基酸影响 IBDV 的复制
4.3.4 VP1 聚合酶活性的改变是 145-147 位氨基酸影响 IBDV 复制及致病性的分子机制之一
4.3.5 VP1 中心活性区及 C 端氨基酸影响 IBDV 的复制
4.3.6 VP1 对 IBDV 复制及致病性影响具有多位点效应
第五章 影响 IBDV VP1 聚合酶活性的分子机制研究
5.1 材料和方法
5.1.1 细胞、抗体和载体
5.1.2 主要试剂
5.1.3 引物设计与合成
5.1.4 IBDV VP3 蛋白对 VP1 聚合酶活性的影响
5.1.5 α-半乳糖苷酶定量分析实验
5.1.6 宿主翻译起始因子 eIF4AII 基因的扩增及克隆
5.1.7 宿主翻译起始因子 eIF4AII 荧光定量 PCR 的建立
5.1.8 宿主翻译起始因子 eIF4AII 在细胞及组织中的分布检测
5.1.9 IBDV VP1 蛋白与宿主 eIF4AII 相互作用研究
5.1.10 宿主 eIF4AII 对 IBDV 复制的影响
5.1.11 宿主 eIF4AII 对 IBDV VP1 聚合酶活性的影响
5.2 结果
5.2.1 IBDV VP3 影响 VP1 聚合酶活性
5.2.2 α-半乳糖苷酶活性检测
5.2.3 宿主翻译起始因子 eIF4AII 基因的扩增及克隆
5.2.4 宿主翻译起始因子 eIF4AII 荧光定量 PCR 的建立
5.2.5 宿主翻译起始因子 eIF4AII 在组织及细胞中的分布
5.2.6 宿主翻译起始因子 eIF4AII 与 IBDV VP1 蛋白之间存在相互作用
5.2.7 宿主 eIF4AII 对 IBDV 复制的影响
5.2.8 宿主 eIF4AII 对 IBDV VP1 聚合酶活性的影响
5.3 讨论
5.3.1 IBDV VP3 蛋白是 VP1 发挥聚合酶活性的必要因素
5.3.2 宿主 eIF4AII 因子与 IBDV VP1 蛋白之间存在相互作用
5.3.3 eIF4AII 抑制 VP1 聚合酶活性是抑制 IBDV 复制的分子机制之一
5.3.4 VP1 N 端 145-147 位氨基酸基序聚合酶活性的差异与 VP3 或 eIF4AII 之间不存在正相关关系
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于RNA聚合酶Ⅱ的传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立 [J]. 魏永伟,侯贤宏,章晓栋,徐弘,吕冬梅,于涟. 中国预防兽医学报. 2008(10)
[2]鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白研究进展 [J]. 祁小乐,王笑梅,高玉龙,高宏雷. 中国预防兽医学报. 2008(08)
[3]河南省传染性法氏囊病病毒分子流行病学调查 [J]. 李银聚,吴庭才,张春杰,程相朝,余祖华,王栓伟,陈溥言. 中国家禽. 2007(08)
[4]安徽省鸡免疫抑制性疾病的流行病学调查 [J]. 杨克礼,韦平,潘玲,蒋玲艳,李莉萍,阳秀英,磨美兰,韦天超. 中国兽医科技. 2005(08)
[5]Pathogenic Antigenic and Molecular Characterization of the Very Virulent Strain(Gx) of Infectious Bursal Disease Virus Isolated in China [J]. Wallace B L lim. Agricultural Sciences in China. 2003(05)
[6]鸡传染性法氏囊病超强毒致弱株的生物学特性研究 [J]. 王笑梅,王秀荣,陈冠春,尹训南,邱冬. 中国预防兽医学报. 1999(06)
[7]传染性法氏囊病病毒的生态学与流行病学研究 [J]. 周宗安,王永山,邓小昭,刁振宇,高建,施正良,罗函禄,方元. 中国兽医学报. 1998(05)
[8]麻雀自然感染鸡传染性法氏囊病病毒的调查 [J]. 王永山,周宗安,翟春生,王元伦,方元,顾志香,王军,肖元廷. 中国兽医学报. 1994(03)
[9]广东地区鸡传染性囊病的研究 [J]. 毕英佐. 华南农业大学学报. 1985(01)
[10]北京地区鸡传染性法氏囊病病原分离 [J]. 周蛟,刘福致,陈丽永,王淑娟. 中国兽医杂志. 1982(07)
博士论文
[1]鸡传染性法氏囊病病毒基因突变株的构建及VP5蛋白功能研究[D]. 秦立廷.中国农业科学院. 2009
[2]我国部分地区传染性法氏囊病分子流行病学研究[D]. 宇文延青.中国农业科学院. 2008
[3]鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究[D]. 祁小乐.中国农业科学院. 2007
硕士论文
[1]利用反向遗传操作技术构建IBDV候选疫苗株的研究[D]. 高立.中国农业科学院. 2010
本文编号：3543462
【文章来源】： 中国农业科学院北京市
【文章页数】：127 页
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摘要
Abstract
图表目录
英文缩略表
第一章 引言
1.1 IBD 概况
1.1.1 IBD 的流行特点
1.1.2 IBD 的防制
1.2 IBDV 的结构和分子生物学
1.2.1 IBDV 的形态学及血清型分类
1.2.2 IBDV 的基因组和编码蛋白
1.3 IBDV 的拯救系统
1.3.1 体外转录拯救系统
1.3.2 基于 T7 RNA 聚合酶的体内转录拯救系统
1.3.3 RNA 聚合酶 II 表达拯救系统
1.3.4 vvIBDV 的拯救
1.4 IBDV 的研究进展
1.4.1 关于 IBDV A 节段的研究
1.4.2 关于 IBDV B 节段的研究
1.5 问题与展望
1.6 本研究的目的及意义
第二章 IBDV 全基因组的克隆与序列分析
2.1 材料与方法
2.1.1 病毒、鸡胚及实验动物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 引物设计及合成
2.1.4 病毒复状
2.1.5 鸡胚半数致死量（ELD50）的测定
2.1.6 SPF 鸡致死率的测定
2.1.7 IBDV 全基因组 RNA 的提取
2.1.8 IBDV 全基因组 RNA 的反转录
2.1.9 IBDV 全基因组克隆
2.1.10 IBDV 全基因组遗传演化分析
2.2 结果
2.2.1 ELD50及 SPF 鸡致死率的测定
2.2.2 IBDV 全基因组扩增及测序
2.2.3 IBDV 全基因组遗传演化分析
2.2.4 VP1 编码氨基酸序列比对
2.3 讨论
第三章 不同亚群 VP1 蛋白对 IBDV 致病性作用研究
3.1 材料和方法
3.1.1 质粒、细胞和单克隆抗体
3.1.2 主要试剂
3.1.3 引物设计与合成
3.1.4 核酶结构的引入
3.1.5 全基因组真核表达质粒的构建
3.1.6 病毒拯救
3.1.7 拯救病毒 IFA 检测
3.1.8 拯救病毒电镜观察
3.1.9 拯救病毒 RT-PCR 鉴定
3.1.10 拯救细胞适应病毒体外复制动力学研究
3.1.11 拯救细胞非适应病毒 ELD50的测定
3.1.12 拯救病毒致病性研究
3.2 结果
3.2.1 感染性克隆的构建
3.2.2 细胞适应病毒的拯救与鉴定
3.2.3 细胞非适应病毒的拯救与鉴定
3.2.4 细胞适应病毒体外复制动力学研究
3.2.5 拯救重组细胞非适应病毒 ELD50的测定
3.2.6 试验鸡症状及剖检变化
3.2.7 重组病毒体内复制动力学研究
3.2.8 试验鸡的囊重比及囊指数
3.2.9 试验鸡法氏囊的组织病理学变化
3.2.10 细胞非适应病毒对 SPF 鸡的致死率
3.3 讨论
3.3.1 VP1 蛋白影响 IBDV 的复制及致病性
3.3.2 A 节段在 IBDV 的复制及致病性方面仍扮演重要角色
第四章 VP1 N 端 145-147 位氨基酸影响 IBDV 的致病性
4.1 材料和方法
4.1.1 质粒、细胞和单克隆抗体
4.1.2 主要试剂
4.1.3 引物设计与合成
4.1.4 IBDV VP1 N 端氨基酸序列比对
4.1.5 感染性克隆的构建
4.1.6 病毒拯救
4.1.7 细胞适应毒 IFA 检测
4.1.8 拯救病毒电镜观察
4.1.9 拯救病毒 RT-PCR 鉴定
4.1.10 细胞适应病毒体外复制动力学研究
4.1.11 细胞非适应病毒 ELD50的测定
4.1.12 病毒致病性研究
4.1.13 minigenome 质粒的构建
4.1.14 VP1 聚合酶活性的检测
4.2 结果
4.2.1 IBDV VP1 N 端氨基酸序列比对
4.2.2 感染性克隆的构建
4.2.3 细胞适应病毒的鉴定
4.2.4 细胞非适应病毒的鉴定
4.2.5 细胞适应病毒体外复制动力学研究
4.2.6 细胞非适应病毒 ELD50的测定
4.2.7 试验鸡症状及剖检变化
4.2.8 重组病毒体内复制动力学研究
4.2.9 试验鸡的囊重比及囊指数
4.2.10 试验鸡法氏囊的组织病理学变化
4.2.11 细胞非适应病毒对 SPF 鸡的致死率
4.2.12 VP1 聚合酶活性的检测
4.3 讨论
4.3.1 VP1 N 端 145-147 位氨基酸存在 3 种独特的基序
4.3.2 VP1 N 端 145-147 位氨基酸影响 IBDV 的致病性
4.3.3 VP1 N 端 145-147 位氨基酸影响 IBDV 的复制
4.3.4 VP1 聚合酶活性的改变是 145-147 位氨基酸影响 IBDV 复制及致病性的分子机制之一
4.3.5 VP1 中心活性区及 C 端氨基酸影响 IBDV 的复制
4.3.6 VP1 对 IBDV 复制及致病性影响具有多位点效应
第五章 影响 IBDV VP1 聚合酶活性的分子机制研究
5.1 材料和方法
5.1.1 细胞、抗体和载体
5.1.2 主要试剂
5.1.3 引物设计与合成
5.1.4 IBDV VP3 蛋白对 VP1 聚合酶活性的影响
5.1.5 α-半乳糖苷酶定量分析实验
5.1.6 宿主翻译起始因子 eIF4AII 基因的扩增及克隆
5.1.7 宿主翻译起始因子 eIF4AII 荧光定量 PCR 的建立
5.1.8 宿主翻译起始因子 eIF4AII 在细胞及组织中的分布检测
5.1.9 IBDV VP1 蛋白与宿主 eIF4AII 相互作用研究
5.1.10 宿主 eIF4AII 对 IBDV 复制的影响
5.1.11 宿主 eIF4AII 对 IBDV VP1 聚合酶活性的影响
5.2 结果
5.2.1 IBDV VP3 影响 VP1 聚合酶活性
5.2.2 α-半乳糖苷酶活性检测
5.2.3 宿主翻译起始因子 eIF4AII 基因的扩增及克隆
5.2.4 宿主翻译起始因子 eIF4AII 荧光定量 PCR 的建立
5.2.5 宿主翻译起始因子 eIF4AII 在组织及细胞中的分布
5.2.6 宿主翻译起始因子 eIF4AII 与 IBDV VP1 蛋白之间存在相互作用
5.2.7 宿主 eIF4AII 对 IBDV 复制的影响
5.2.8 宿主 eIF4AII 对 IBDV VP1 聚合酶活性的影响
5.3 讨论
5.3.1 IBDV VP3 蛋白是 VP1 发挥聚合酶活性的必要因素
5.3.2 宿主 eIF4AII 因子与 IBDV VP1 蛋白之间存在相互作用
5.3.3 eIF4AII 抑制 VP1 聚合酶活性是抑制 IBDV 复制的分子机制之一
5.3.4 VP1 N 端 145-147 位氨基酸基序聚合酶活性的差异与 VP3 或 eIF4AII 之间不存在正相关关系
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于RNA聚合酶Ⅱ的传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立 [J]. 魏永伟,侯贤宏,章晓栋,徐弘,吕冬梅,于涟. 中国预防兽医学报. 2008(10)
[2]鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白研究进展 [J]. 祁小乐,王笑梅,高玉龙,高宏雷. 中国预防兽医学报. 2008(08)
[3]河南省传染性法氏囊病病毒分子流行病学调查 [J]. 李银聚,吴庭才,张春杰,程相朝,余祖华,王栓伟,陈溥言. 中国家禽. 2007(08)
[4]安徽省鸡免疫抑制性疾病的流行病学调查 [J]. 杨克礼,韦平,潘玲,蒋玲艳,李莉萍,阳秀英,磨美兰,韦天超. 中国兽医科技. 2005(08)
[5]Pathogenic Antigenic and Molecular Characterization of the Very Virulent Strain(Gx) of Infectious Bursal Disease Virus Isolated in China [J]. Wallace B L lim. Agricultural Sciences in China. 2003(05)
[6]鸡传染性法氏囊病超强毒致弱株的生物学特性研究 [J]. 王笑梅,王秀荣,陈冠春,尹训南,邱冬. 中国预防兽医学报. 1999(06)
[7]传染性法氏囊病病毒的生态学与流行病学研究 [J]. 周宗安,王永山,邓小昭,刁振宇,高建,施正良,罗函禄,方元. 中国兽医学报. 1998(05)
[8]麻雀自然感染鸡传染性法氏囊病病毒的调查 [J]. 王永山,周宗安,翟春生,王元伦,方元,顾志香,王军,肖元廷. 中国兽医学报. 1994(03)
[9]广东地区鸡传染性囊病的研究 [J]. 毕英佐. 华南农业大学学报. 1985(01)
[10]北京地区鸡传染性法氏囊病病原分离 [J]. 周蛟,刘福致,陈丽永,王淑娟. 中国兽医杂志. 1982(07)
博士论文
[1]鸡传染性法氏囊病病毒基因突变株的构建及VP5蛋白功能研究[D]. 秦立廷.中国农业科学院. 2009
[2]我国部分地区传染性法氏囊病分子流行病学研究[D]. 宇文延青.中国农业科学院. 2008
[3]鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究[D]. 祁小乐.中国农业科学院. 2007
硕士论文
[1]利用反向遗传操作技术构建IBDV候选疫苗株的研究[D]. 高立.中国农业科学院. 2010
本文编号：3543462
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