滑液支原体膜表面丙酮酸脱羧酶的生物学特性研究
发布时间：2022-02-10 15:37
滑液支原体（Mycoplasma synoviae, MS）是严重危害养禽业的一种重要的病原微生物,其在世界各地的养鸡场中均有分布,给养禽产业带来了严重威胁。近年来的流行病学调查资料表明,滑液支原体感染呈扩大和蔓延之势,其危害亦日显严重,甚至可能会超过鸡毒支原体而成为危害养禽业头号支原体病。滑液支原体主要引起鸡和火鸡的呼吸道感染及关节炎,而蛋鸡输卵管的损伤亦被证实与滑液支原体有关。不同的毒力株滑液支原体的感染性、组织嗜性和致病性有所不同。因此,滑液支原体感染后可有不同的临床表现。虽然滑液支原体的感染极少直接造成禽类的死亡,但其导致的生长迟滞,蛋壳畸形,死淘率上升、肉鸡胴体废弃率增加以及防控所需的大量投入,均可造成严重的经济损失。而且,滑液支原体的感染可导致新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌等病原微生物的混合或继发感染,从而使损失加剧。目前,由于尚无有效的疫苗可供使用,滑液支原体感染的防控主要通过加强生产管理,改善饲养条件和合理应用抗生素等措施,但亦很难对该病完全控制和彻底清除。因此,开展滑液支原体相关的研究,必将为滑液支原体感染的有效预防和控制奠定理论基础。基于此...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 绪论
1.1 支原体及滑液支原体
1.1.1 支原体
1.1.2 滑液支原体
1.2 蛋白质组学及其研究内容、技术和在兽医研究中的应用
1.2.1 蛋白质组学研究的内容
1.2.2 蛋白质组学研究技术
1.2.3 蛋白质组学在兽医研究中的应用
1.3 滑液支原体蛋白质组学研究
1.4 本研究的目的和意义
第二章 滑液支原体WV_(1853)株主要免疫相关膜蛋白的鉴定
摘要
2.1 材料与方法
2.1.1 菌株和培养条件
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.1.4 培养基,主要缓冲液及试剂的配制
2.1.5 滑液支原体的培养
2.1.6 WVU_(1853)株兔多抗及鸡多抗的制备
2.1.7 制备膜蛋白
2.1.8 蛋白质的双向电泳
2.1.9 免疫印迹
2.1.10 质谱分析
2.2 结果
2.2.1 MS WVU_(1853)株膜蛋白及亲水蛋白的SDS-PAGE结果
2.2.2 MS WVU_(1853)株膜蛋白的Western blot结果
2.2.3 质谱结果及数据分析
2.3 讨论
第三章 基于冰核蛋白N-端结构域的大肠杆菌表面展示载体的构建及在支原体粘附蛋白鉴定中的应用
摘要
3.1 材料和方法
3.1.1 菌种和质粒
3.1.2 细胞系
3.1.3 化学试剂、酶及抗体
3.1.4 主要仪器
3.1.5 培养基,主要缓冲液及试剂的配制
3.1.6 鸡毒支原体的培养
3.1.7 鸡毒支原体基因组的粗提
3.1.8 细胞培养
3.1.9 截短的冰核蛋白N-末端DNA序列的合成及质粒构建
3.1.10 融合蛋白的表达
3.1.11 EGFP荧光检测
3.1.12 大肠杆菌细胞的分级分离
3.1.13 SDS-PAGE及Western blot分析
3.1.14 免疫荧光显微镜观察
3.1.15 全菌的ELISA检测
3.1.16 InaZN-EGFP-Mgc2阳性表达菌对宿主细胞的粘附试验
3.2 结果
3.2.1 细胞膜表面展示载体的构建
3.2.2 融合蛋白InaZN/EGFP及InaZN/EGFP/Mgc2的表达
3.2.3 融合蛋白的定位
3.2.4 重组的融合蛋白在细胞表面的展示
3.2.5. 表面展示Mgc2的大肠杆菌对DF-1细胞的粘附
3.3 讨论
第四章 滑液支原体丙酮酸脱羧酶A亚基生物学特性研究
摘要
4.1 材料和方法
4.1.1 菌种、载体
4.1.2 抗体及实验动物
4.1.3 主要试剂
4.1.4 主要仪器
4.1.5 培养基、主要缓冲液及试剂配制
4.1.6 MS基因组的提取
4.1.7 pdcA基因的克隆及载体的构建
4.1.8 pdcA基因的原核表达及蛋白纯化
4.1.9 PDCA兔多抗的制备
4.1.10 PDCA在MS细胞内的分布分析
4.1.11 PDCA与Plg和Fn结合试验
4.1.12 PDCA多抗介导的补体杀菌实验
4.1.13 粘附及其粘附抑制实验
4.1.14 PDCA~+Ecoli DF-1细胞的粘附及其粘附抑制实验
4.2 结果
4.2.1 pdcA基因的克隆
4.2.2 pdcA基因的表达
4.2.3 pdcA基因表达产物的纯化
4.2.4 PDCA兔多抗效价的检测
4.2.5 PDCA在细胞内的分布
4.2.6 PDCA与鸡的血纤溶酶原(Plg)和人的纤连蛋白(Fn)的结合活性
4.2.7 PDCA多抗血清的体外杀菌实验
4.2.8 PDCA抗血清的粘附抑制实验
4.2.9 PDCA~+E.coli DF-1细胞的粘附及其粘附抑制实验
4.3 讨论
第五章 滑液支原体丙酮酸脱羧酶B亚基生物学特性研究
摘要
5.1 材料和方法
5.1.1 菌种、载体
5.1.2 抗体及及实验动物
5.1.3 主要试剂
5.1.4 主要仪器
5.1.5 主要缓冲液及试剂配制
5.1.6 MS基因组的提取
5.1.7 pdcB基因的克隆及载体的构建
5.1.8 pdcB基因的原核表达
5.1.9 重组蛋白的纯化
5.1.10 PDCB兔多抗的制备
5.1.11 PDCB在MS细胞内的分布
5.1.12 PDCB与Plg和Fn结合试验
5.1.13 His-PDCB多抗介导的补体杀菌实验
5.1.14 粘附及其粘附抑制实验
5.1.15 PDCB~+E.coli对DF-1细胞的粘附及其粘附抑制实验
5.2 结果
5.2.1 pdcB基因的克隆
5.2.2 pdcB基因的表达
5.2.3 pdcB基因表达产物的纯化
5.2.4 His-PDCB兔多抗效价的检测
5.2.5 PDCB在细胞内的分布
5.2.6 纤溶酶原(Plg)及纤连蛋白(Fn)与His-PDCB的结合活性
5.2.7 His-PDCB抗血清的体外杀菌实验
5.2.8 PDCB抗血清的粘附抑制实验
5.2.9 PDCB~+E.coli D F-1细胞的粘附及其粘附抑制实验
5.3 讨论
第六章 MS WVU_(1853)株pdcA/pdcB基因共表达质粒的构建及原核表达
摘要
6.1 材料和方法
6.1.1 菌种、载体
6.1.2 抗体
6.1.3 主要试剂
6.1.4 主要仪器
6.1.5 主要缓冲液及试剂配制
6.1.6 共表达载体的构建
6.1.7 pdcA及pdcB基因的原核共表达
6.1.8 共表达蛋白的纯化
6.1.9 共表达产物酶活性测定
6.1.10 pET-AB表达纯化产物的酶促米氏常数
6.2 结果
6.2.1 pdcB基因的克隆
6.2.2 pdcA及pdcB基因的共表达
6.2.3 pdcB基因表达产物的纯化
6.2.4 共表达产物酶活性测定
6.2.5 pET-AB表达纯化产物的酶促米氏常数
6.3 讨论
第七章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]滑液支原体的危害或将增大[J]. 于圣青. 中国家禽. 2013(17)
[2]蛋白质组学方法及其在农业生物科研领域的应用[J]. 孔谦,陈中健,贝锦龙,崔百元,张卫娜,贾谏,陈庄. 广东农业科学. 2013(15)
[3]Fibronectin: Functional character and role in alcoholic liver disease[J]. Razia S Aziz-Seible,Carol A Casey. World Journal of Gastroenterology. 2011(20)
[4]多基因在大肠杆菌中的共表达策略[J]. 耿风廷,赵晓瑜,高珊. 生物技术通讯. 2007(02)
[5]蛋白质组学研究的内容、方法及意义[J]. 司英健. 国外医学.临床生物化学与检验学分册. 2003(03)
本文编号：3619092
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 绪论
1.1 支原体及滑液支原体
1.1.1 支原体
1.1.2 滑液支原体
1.2 蛋白质组学及其研究内容、技术和在兽医研究中的应用
1.2.1 蛋白质组学研究的内容
1.2.2 蛋白质组学研究技术
1.2.3 蛋白质组学在兽医研究中的应用
1.3 滑液支原体蛋白质组学研究
1.4 本研究的目的和意义
第二章 滑液支原体WV_(1853)株主要免疫相关膜蛋白的鉴定
摘要
2.1 材料与方法
2.1.1 菌株和培养条件
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要仪器
2.1.4 培养基,主要缓冲液及试剂的配制
2.1.5 滑液支原体的培养
2.1.6 WVU_(1853)株兔多抗及鸡多抗的制备
2.1.7 制备膜蛋白
2.1.8 蛋白质的双向电泳
2.1.9 免疫印迹
2.1.10 质谱分析
2.2 结果
2.2.1 MS WVU_(1853)株膜蛋白及亲水蛋白的SDS-PAGE结果
2.2.2 MS WVU_(1853)株膜蛋白的Western blot结果
2.2.3 质谱结果及数据分析
2.3 讨论
第三章 基于冰核蛋白N-端结构域的大肠杆菌表面展示载体的构建及在支原体粘附蛋白鉴定中的应用
摘要
3.1 材料和方法
3.1.1 菌种和质粒
3.1.2 细胞系
3.1.3 化学试剂、酶及抗体
3.1.4 主要仪器
3.1.5 培养基,主要缓冲液及试剂的配制
3.1.6 鸡毒支原体的培养
3.1.7 鸡毒支原体基因组的粗提
3.1.8 细胞培养
3.1.9 截短的冰核蛋白N-末端DNA序列的合成及质粒构建
3.1.10 融合蛋白的表达
3.1.11 EGFP荧光检测
3.1.12 大肠杆菌细胞的分级分离
3.1.13 SDS-PAGE及Western blot分析
3.1.14 免疫荧光显微镜观察
3.1.15 全菌的ELISA检测
3.1.16 InaZN-EGFP-Mgc2阳性表达菌对宿主细胞的粘附试验
3.2 结果
3.2.1 细胞膜表面展示载体的构建
3.2.2 融合蛋白InaZN/EGFP及InaZN/EGFP/Mgc2的表达
3.2.3 融合蛋白的定位
3.2.4 重组的融合蛋白在细胞表面的展示
3.2.5. 表面展示Mgc2的大肠杆菌对DF-1细胞的粘附
3.3 讨论
第四章 滑液支原体丙酮酸脱羧酶A亚基生物学特性研究
摘要
4.1 材料和方法
4.1.1 菌种、载体
4.1.2 抗体及实验动物
4.1.3 主要试剂
4.1.4 主要仪器
4.1.5 培养基、主要缓冲液及试剂配制
4.1.6 MS基因组的提取
4.1.7 pdcA基因的克隆及载体的构建
4.1.8 pdcA基因的原核表达及蛋白纯化
4.1.9 PDCA兔多抗的制备
4.1.10 PDCA在MS细胞内的分布分析
4.1.11 PDCA与Plg和Fn结合试验
4.1.12 PDCA多抗介导的补体杀菌实验
4.1.13 粘附及其粘附抑制实验
4.1.14 PDCA~+Ecoli DF-1细胞的粘附及其粘附抑制实验
4.2 结果
4.2.1 pdcA基因的克隆
4.2.2 pdcA基因的表达
4.2.3 pdcA基因表达产物的纯化
4.2.4 PDCA兔多抗效价的检测
4.2.5 PDCA在细胞内的分布
4.2.6 PDCA与鸡的血纤溶酶原(Plg)和人的纤连蛋白(Fn)的结合活性
4.2.7 PDCA多抗血清的体外杀菌实验
4.2.8 PDCA抗血清的粘附抑制实验
4.2.9 PDCA~+E.coli DF-1细胞的粘附及其粘附抑制实验
4.3 讨论
第五章 滑液支原体丙酮酸脱羧酶B亚基生物学特性研究
摘要
5.1 材料和方法
5.1.1 菌种、载体
5.1.2 抗体及及实验动物
5.1.3 主要试剂
5.1.4 主要仪器
5.1.5 主要缓冲液及试剂配制
5.1.6 MS基因组的提取
5.1.7 pdcB基因的克隆及载体的构建
5.1.8 pdcB基因的原核表达
5.1.9 重组蛋白的纯化
5.1.10 PDCB兔多抗的制备
5.1.11 PDCB在MS细胞内的分布
5.1.12 PDCB与Plg和Fn结合试验
5.1.13 His-PDCB多抗介导的补体杀菌实验
5.1.14 粘附及其粘附抑制实验
5.1.15 PDCB~+E.coli对DF-1细胞的粘附及其粘附抑制实验
5.2 结果
5.2.1 pdcB基因的克隆
5.2.2 pdcB基因的表达
5.2.3 pdcB基因表达产物的纯化
5.2.4 His-PDCB兔多抗效价的检测
5.2.5 PDCB在细胞内的分布
5.2.6 纤溶酶原(Plg)及纤连蛋白(Fn)与His-PDCB的结合活性
5.2.7 His-PDCB抗血清的体外杀菌实验
5.2.8 PDCB抗血清的粘附抑制实验
5.2.9 PDCB~+E.coli D F-1细胞的粘附及其粘附抑制实验
5.3 讨论
第六章 MS WVU_(1853)株pdcA/pdcB基因共表达质粒的构建及原核表达
摘要
6.1 材料和方法
6.1.1 菌种、载体
6.1.2 抗体
6.1.3 主要试剂
6.1.4 主要仪器
6.1.5 主要缓冲液及试剂配制
6.1.6 共表达载体的构建
6.1.7 pdcA及pdcB基因的原核共表达
6.1.8 共表达蛋白的纯化
6.1.9 共表达产物酶活性测定
6.1.10 pET-AB表达纯化产物的酶促米氏常数
6.2 结果
6.2.1 pdcB基因的克隆
6.2.2 pdcA及pdcB基因的共表达
6.2.3 pdcB基因表达产物的纯化
6.2.4 共表达产物酶活性测定
6.2.5 pET-AB表达纯化产物的酶促米氏常数
6.3 讨论
第七章 全文结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]滑液支原体的危害或将增大[J]. 于圣青. 中国家禽. 2013(17)
[2]蛋白质组学方法及其在农业生物科研领域的应用[J]. 孔谦,陈中健,贝锦龙,崔百元,张卫娜,贾谏,陈庄. 广东农业科学. 2013(15)
[3]Fibronectin: Functional character and role in alcoholic liver disease[J]. Razia S Aziz-Seible,Carol A Casey. World Journal of Gastroenterology. 2011(20)
[4]多基因在大肠杆菌中的共表达策略[J]. 耿风廷,赵晓瑜,高珊. 生物技术通讯. 2007(02)
[5]蛋白质组学研究的内容、方法及意义[J]. 司英健. 国外医学.临床生物化学与检验学分册. 2003(03)
本文编号：3619092
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3619092.html
