猪瘟病毒NS2-3蛋白抗原集中区基因的真核表达
发布时间：2022-04-26 22:39
猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起一种高度接触性和高致死性传染病,给世界各国的养猪业带来了严重危害。近年来,随着CSFV研究的深入,新型疫苗的研制和先进诊断方法的出现,对控制CSF方面发挥了巨大作用。NS2-3蛋白是CSFV的非结构蛋白,具有很好的免疫优势。本研究从携带猪瘟兔化弱毒（Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV）全长基因组c DNA质粒中扩增NS2-3基因的抗原表位集中区基因,扩增长度为789bp,将其命名为NS2-32。将目的片段和表达载体p PICZαC分别经Eco R I和Xba I限制性内切酶双酶切,然后连接转化至大肠杆菌,得到重组表达质粒p PICZαC-NS2-32。经PCR和双酶切鉴定后进行测序鉴定,重组表达质粒p PICZαC-NS2-32经Sac I限制性内切酶单酶切线性化之后,电击转化至P.pastoris工程菌感受态X-33。筛选出高抗性阳性菌株,通过改变温度、培养基p H值、甲醇流加量,摸索诱导表达条件,诱导条件包括:（1）诱导温度为:22℃、24℃、26℃、28℃;（2）诱导p H值为:4.0、5.0、6.0、7.0...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
缩略词表
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1 CSFV的结构和特性
2 CSFV的侵入机制
3 CSFV的基因组和编码蛋白
3.1 C蛋白
3.2 E~(rns)蛋白
3.3 E1蛋白
3.4 E2蛋白
3.5 Npro蛋白
3.6 p7蛋白
3.7 NS2-3 蛋白
3.8 NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白
4 CSF的实验室诊断
4.1 动物实验
4.2 病毒分离
4.3 血清学诊断
4.4 分子生物学诊断
4.5 细胞检查法
5 CSFV新型疫苗研究进展
5.1 合成肽疫苗
5.2 亚单位疫苗
5.3 嵌合CSFV疫苗
5.4 基因缺失型弱毒疫苗
5.5 DNA疫苗
6 P.pastoris表达系统的一般特征
6.1 外源基因的内在特性的影响
6.2 宿主菌的选择
6.3 表达载体
6.4 发酵条件对表达的影响
第二章 CSFV NS2-3 蛋白抗原表位集中区的真核表达与鉴定
1 材料
1.1 质粒和宿主菌
1.2 主要试剂和酶类
1.3 主要仪器设备
1.4 主要试剂配制
2 方法
2.1 CSFV NS2-3_2 基因的PCR扩增、克隆和鉴定
2.2 重组克隆载体的构建
2.3 重组表达质粒p PICZαC-NS2-3_2 的构建
2.4 携带目的基因的重组酵母的构建
2.5 高抗性重组子的初步诱导表达
2.6 诱导条件的摸索
2.7 表达产物的SDS-PAGE鉴定
2.8 目的蛋白的Western blotting鉴定
3 结果与分析
3.1 目的基因的PCR扩增
3.2 重组克隆质粒的转化
3.3 重组克隆质粒的菌液PCR鉴定
3.4 重组克隆质粒的双酶切鉴定
3.5 CSFV NS2-3_2 和表达载体的连接
3.6 重组表达质粒p PICZαC-NS2-3_2 的PCR鉴定和双酶切鉴定
3.7 高抗性重组酵母菌的筛选
3.8 高抗性重组酵母菌菌液PCR鉴定
3.9 表达产物的SDS-PAGE分析
4 讨论
4.1 密码子偏嗜性
4.2 A+T含量
4.3 过度糖基化
4.4 目的蛋白的降解
4.5 甲醇的影响
4.6 信号肽的影响
5 小结
全文总结
参考文献
攻读学位期间取得的成绩
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]新型猪瘟疫苗的研究进展[J]. 张双,郭慧,徐浩,孟繁星,胡桂学. 中国兽医杂志. 2015(01)
[2]猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位[J]. 宋江伟,田宏,吴锦艳,陈妍,尚佑军,刘湘涛. 西北农业学报. 2014(08)
[3]猪瘟活疫苗与口蹄疫灭活疫苗同期与分期免疫效果对比试验[J]. 王克才,何利昆,谷志大,段亚良,杨国丽,郑洪玲,肖爱波. 现代畜牧兽医. 2014(04)
[4]猪瘟病毒Erns蛋白RNase活性与免疫抑制功能的相关性研究[J]. 赵天生,张悦之,夏燕华. 河南农业科学. 2014(03)
[5]规模化猪场猪瘟发病新特征及预防[J]. 毛泽明,加春生,毛泽天,王晓楠,王龙,陈爽,葛兰云. 黑龙江畜牧兽医. 2014(02)
[6]猪瘟病毒NS2-3抗原集中区基因的原核表达及鉴定[J]. 刘卫,朱艳平,宁红梅,银梅,郭东光,鲁毅,王选年. 基因组学与应用生物学. 2013(02)
[7]猪瘟诊断技术的研究进展[J]. 杭丽,皇甫抗栋,沈玉磊. 中国畜禽种业. 2013(01)
[8]甲醇浓度对毕赤酵母表达重组人复合α干扰素分离纯化得率的影响[J]. 吴丹,储炬,王永红,庄英萍,张嗣良. 生物工程学报. 2011(12)
[9]猪瘟病毒NS2 3′端基因的克隆与原核表达[J]. 杨幼聪,张彦明,康恺,向华,汤智慧,张三东. 动物医学进展. 2011(05)
[10]毕赤酵母X-33OCH1基因敲除菌株的构建及其表达低糖基化蛋白GM-CSF[J]. 张大成,许永利,辛鑫,朱瑞宇,金坚. 微生物学报. 2011(05)
本文编号：3648861
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
缩略词表
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1 CSFV的结构和特性
2 CSFV的侵入机制
3 CSFV的基因组和编码蛋白
3.1 C蛋白
3.2 E~(rns)蛋白
3.3 E1蛋白
3.4 E2蛋白
3.5 Npro蛋白
3.6 p7蛋白
3.7 NS2-3 蛋白
3.8 NS4A、NS4B、NS5A、NS5B蛋白
4 CSF的实验室诊断
4.1 动物实验
4.2 病毒分离
4.3 血清学诊断
4.4 分子生物学诊断
4.5 细胞检查法
5 CSFV新型疫苗研究进展
5.1 合成肽疫苗
5.2 亚单位疫苗
5.3 嵌合CSFV疫苗
5.4 基因缺失型弱毒疫苗
5.5 DNA疫苗
6 P.pastoris表达系统的一般特征
6.1 外源基因的内在特性的影响
6.2 宿主菌的选择
6.3 表达载体
6.4 发酵条件对表达的影响
第二章 CSFV NS2-3 蛋白抗原表位集中区的真核表达与鉴定
1 材料
1.1 质粒和宿主菌
1.2 主要试剂和酶类
1.3 主要仪器设备
1.4 主要试剂配制
2 方法
2.1 CSFV NS2-3_2 基因的PCR扩增、克隆和鉴定
2.2 重组克隆载体的构建
2.3 重组表达质粒p PICZαC-NS2-3_2 的构建
2.4 携带目的基因的重组酵母的构建
2.5 高抗性重组子的初步诱导表达
2.6 诱导条件的摸索
2.7 表达产物的SDS-PAGE鉴定
2.8 目的蛋白的Western blotting鉴定
3 结果与分析
3.1 目的基因的PCR扩增
3.2 重组克隆质粒的转化
3.3 重组克隆质粒的菌液PCR鉴定
3.4 重组克隆质粒的双酶切鉴定
3.5 CSFV NS2-3_2 和表达载体的连接
3.6 重组表达质粒p PICZαC-NS2-3_2 的PCR鉴定和双酶切鉴定
3.7 高抗性重组酵母菌的筛选
3.8 高抗性重组酵母菌菌液PCR鉴定
3.9 表达产物的SDS-PAGE分析
4 讨论
4.1 密码子偏嗜性
4.2 A+T含量
4.3 过度糖基化
4.4 目的蛋白的降解
4.5 甲醇的影响
4.6 信号肽的影响
5 小结
全文总结
参考文献
攻读学位期间取得的成绩
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]新型猪瘟疫苗的研究进展[J]. 张双,郭慧,徐浩,孟繁星,胡桂学. 中国兽医杂志. 2015(01)
[2]猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位[J]. 宋江伟,田宏,吴锦艳,陈妍,尚佑军,刘湘涛. 西北农业学报. 2014(08)
[3]猪瘟活疫苗与口蹄疫灭活疫苗同期与分期免疫效果对比试验[J]. 王克才,何利昆,谷志大,段亚良,杨国丽,郑洪玲,肖爱波. 现代畜牧兽医. 2014(04)
[4]猪瘟病毒Erns蛋白RNase活性与免疫抑制功能的相关性研究[J]. 赵天生,张悦之,夏燕华. 河南农业科学. 2014(03)
[5]规模化猪场猪瘟发病新特征及预防[J]. 毛泽明,加春生,毛泽天,王晓楠,王龙,陈爽,葛兰云. 黑龙江畜牧兽医. 2014(02)
[6]猪瘟病毒NS2-3抗原集中区基因的原核表达及鉴定[J]. 刘卫,朱艳平,宁红梅,银梅,郭东光,鲁毅,王选年. 基因组学与应用生物学. 2013(02)
[7]猪瘟诊断技术的研究进展[J]. 杭丽,皇甫抗栋,沈玉磊. 中国畜禽种业. 2013(01)
[8]甲醇浓度对毕赤酵母表达重组人复合α干扰素分离纯化得率的影响[J]. 吴丹,储炬,王永红,庄英萍,张嗣良. 生物工程学报. 2011(12)
[9]猪瘟病毒NS2 3′端基因的克隆与原核表达[J]. 杨幼聪,张彦明,康恺,向华,汤智慧,张三东. 动物医学进展. 2011(05)
[10]毕赤酵母X-33OCH1基因敲除菌株的构建及其表达低糖基化蛋白GM-CSF[J]. 张大成,许永利,辛鑫,朱瑞宇,金坚. 微生物学报. 2011(05)
本文编号：3648861
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