田鼠巴贝斯虫TrxR氨基酸突变对其酶活性的影响

发布时间：2022-05-02 22:25

　　巴贝斯虫病是一种由巴贝斯虫感染引起的人兽共患原虫病。巴贝斯虫主要寄生于哺乳动物红细胞,在红细胞内繁殖,在此过程中,巴贝斯虫处于有氧环境,受到活性氧（ROS）的毒性效应。巴贝斯虫为了抵抗氧化应激,启动体内的硫氧还蛋白（Trx）系统。硫氧还蛋白还原酶（TrxR）是一种NADPH依赖的包含FAD结合结构域的二聚体硒酶,属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员,它参与防御氧化应激,与硫氧还蛋白（Trx）共同构成关键的硫氧还蛋白抗氧化系统。本研究是在实验室前期克隆和初步鉴定的田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶（Bmi TrxR）酶的基础上,研究了TrxR的抗氧化功能,并将TrxR分子的关键氨基酸突变,研究突变位点对TrxR酶活的影响,确认TrxR的关键催化位点,为药物筛选提供研究基础。通过对感染小鼠红细胞内TrxR和ROS的检测发现,随着染虫率的升高,ROS与TrxR也随之升高,表明TrxR参与抗氧化应激。通过结构域预测与同源性分析,确定了TrxR的活性位点,构建6个突变体Bmi TrxR C105,Bmi TrxR C110,Bmi TrxR C105C110,Bmi TrxR C547,Bmi ... 

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
主要符号表
第一章 文献综述
    1.1 TrxR的结构
    1.2 TrxR的分类
    1.3 TrxR的还原机制
    1.4 TrxR的功能
        1.4.1 参与机体炎症
        1.4.2 参与肿瘤进展
        1.4.3 参与抗毒素
        1.4.4 参与氧化应激
        1.4.5 参与细胞凋亡
    1.5 总结
第二章 Bmi TrxR抗氧化应激功能的研究
    2.1 引言
    2.2 材料与仪器
        2.2.1 实验试剂
        2.2.2 实验仪器
        2.2.3 实验动物
    2.3 实验方法
        2.3.1 虫体冻存与复苏
        2.3.2 田鼠巴贝斯虫的观察
        2.3.3 Bmi TrxR体内抗氧化应激功能研究
            2.3.3.1 样品收集
            2.3.3.2 田鼠巴贝斯虫虫体数检测
            2.3.3.3 Bmi TrxR相对表达水平检测
            2.3.4.4 感染的红细胞中活性氧(ROS)的测定
        2.3.4 Bmi TrxR体外抗氧化应激功能研究
            2.3.4.1 体外培养
            2.3.4.2 细胞样本收集
            2.3.4.3 染色
            2.3.4.4 流式上机
    2.4 实验结果
        2.4.1 Bmi TrxR参与抗氧化应激的体内验证
        2.4.2 Bmi TrxR参与抗氧化应激的体外验证
    2.5 讨论
第三章 Bmi TrxR生物信息学分析、定点突变、蛋白表达纯化
    3.1 引言
    3.2 实验材料与仪器
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 Bmi TrxR的生物信息学分析
        3.3.2 TrxR质粒提取
        3.3.3 引物设计
        3.3.4 定点突变
        3.3.5 重组蛋白的诱导表达
        3.3.6 重组蛋白Bmi TrxR和突变体蛋白的纯化
        3.3.7 蛋白浓度测定
            3.3.7.1 BSA方法
            3.3.7.2 BCA方法
    3.4 实验结果
        3.4.1 Bmi TrxR的生物信息学分析
        3.4.2 定点突变及其蛋白表达纯化
    3.5 讨论
第四章 突变体蛋白酶活实验以及抑制实验
    4.1 前言
    4.2 实验材料与实验仪器
        4.2.1 试剂准备
        4.2.2 主要仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 重组酶Bmi TrxR和突变体的DTNB还原酶活性检测
        4.3.2 突变株的Trx还原酶活性检测
        4.3.3 重组酶BmiTrxR以及突变体的抑制实验
    4.4 实验结果
        4.4.1 TrxR酶活验证和抑制剂筛选
        4.4.2 His标签对TrxR还原活性的影响
        4.4.3 突变位点对Bmi TrxR的酶活性影响
        4.4.4 抑制剂对突变体的抑制作用
    4.5 讨论
第五章 全文总结
参考文献
附录
作者简介
攻读学位期间取得的研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]田鼠巴贝斯虫醛酮还原酶BmAKR2的基因克隆和鉴定[J]. 黄强,曹杰,周勇志,龚海燕,张厚双,周金林.  中国兽医科学. 2017(10)
[2]活性氧与细胞核共染影响因素的实验研究[J]. 罗莉,侯凤艳,严军,梁华平.  第三军医大学学报. 2016(06)
[3]硫氧还蛋白还原酶的生理学功能研究进展[J]. 周润梅.  现代医药卫生. 2012(16)

硕士论文
[1]田鼠巴贝斯虫两个硫氧还蛋白基因的克隆及鉴定[D]. 熊康.上海师范大学 2016
[2]田鼠巴贝斯虫隐性感染小鼠试验及其对其他原虫共感染的影响[D]. 魏金龙.甘肃农业大学 2015
[3]刚地弓形虫SHR虫株生物学特性初步研究[D]. 朱丙伦.广西大学 2015



本文编号：3650075