Hsp 70、EF-Tu在绵羊肺炎支原体血清学诊断的评价和基于LAMP的分子诊断研究
发布时间：2022-07-08 16:02
目的:（1）开发一种简单快速有效,适用于基层的DNA纯化分离方法。（2）建立M.ovipneumoniae核酸扩增的简单快速检测技术。（3）解决M.ovipneumoniae感染的控制预防问题,探索并建立一种简单快速、经济的适用于基层的M.ovipneumoniae检测方法。方法:（1）制备超顺磁性Fe3O4 MCNCs及Fe3O4/SiO2 MCNCs,并用MCNCs从不同样本中提取DNA,包括兔全血,兔冷冻血液和感染M.ovipneumoniae的肺组织等,对其纯度、完整性及产量进行验证。（2）针对M.ovipneumoniae heat shock protein 70（Hsp 70）和elongation factor Tu（EF-Tu）基因各设计一套特异性引物,利用环介导等温扩增（LAMP）技术进行核酸扩增,联合侧向流动试纸条技术（LFD）实现核酸扩增可目视化检测,建立M.ovipneumoniae LAMP-LFD快速检测方法,并对其特异性、敏感性及临床应用进行检测...
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
引言
第一章 文献综述
1 绵羊肺炎支原体的研究概况
1.1 致病机理
1.2 流行病学
1.3 临床特征
2 绵羊肺炎支原体诊断技术
2.1 传统的病原学诊断
2.2 分子生物学方法
2.3 免疫学诊断方法
3 磁性纳米材料的研究进展
3.1 制备方法
3.2 磁性纳米材料的表面修饰
3.3 磁性纳米材料的应用
4 本研究的目的及意义
第二章 超顺磁性纳米簇的合成及其用于DNA提取的研究
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 Fe_3O_4 MCNCs和 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs的表征结果
2.2 Fe_3O_4 MCNCs提取新鲜兔血液基因组DNA
2.3 通过Fe_3O_4 MCNCs提取冷冻血样与新鲜血液样本基因组DNA比较
2.4 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs和 Fe_3O_4 MCNCs从新鲜兔血液中提取基因组DNA比较
2.5 用Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs从大肠杆菌中提取DNA
2.6 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs从金黄色葡萄球菌中提取DNA
2.7 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs从感染绵羊肺炎支原体的肺组织中提取基因组DNA
2.8 PCR检测
3 讨论
第三章 绵羊肺炎支原体环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测方法的建立
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 LAMP检测方法的条件优化
2.2 LAMP-LFD检测方法的建立
2.3 LAMP-LFD检测方法的特异性和重复性试验
2.4 LAMP-LFD灵敏度分析
2.5 临床应用性检测
3 讨论
第四章 绵羊肺炎支原体EF-Tu、Hsp70 蛋白间接ELISA方法的建立
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 pMD18-T-EF-Tu和 pMD18-T-Hsp70 的鉴定
2.2 pET-28a-EF-Tu和 pET-28a-Hsp70 的构建与鉴定
2.3 IPTG最佳诱导条件以及表达形式的确定
2.4 重组蛋白的纯化
2.5 蛋白浓度测定
2.6 重组蛋白Western-blot分析
2.7 间接ELISA方法反应条件的优化
2.8 封闭液的确定以及封闭条件的确定
2.9 一抗最佳孵育时间的确定
2.10 二抗最佳稀释倍数及孵育时间的确定
2.11 阴阳判定临界值标准的确定
2.12 特异性试验
2.13 敏感性试验
2.14 重复性试验
2.15 临床样本检测
3 讨论
全文总结
参考文献
附录
致谢
作者简介
导师评阅表
本文编号：3657326
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
引言
第一章 文献综述
1 绵羊肺炎支原体的研究概况
1.1 致病机理
1.2 流行病学
1.3 临床特征
2 绵羊肺炎支原体诊断技术
2.1 传统的病原学诊断
2.2 分子生物学方法
2.3 免疫学诊断方法
3 磁性纳米材料的研究进展
3.1 制备方法
3.2 磁性纳米材料的表面修饰
3.3 磁性纳米材料的应用
4 本研究的目的及意义
第二章 超顺磁性纳米簇的合成及其用于DNA提取的研究
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 Fe_3O_4 MCNCs和 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs的表征结果
2.2 Fe_3O_4 MCNCs提取新鲜兔血液基因组DNA
2.3 通过Fe_3O_4 MCNCs提取冷冻血样与新鲜血液样本基因组DNA比较
2.4 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs和 Fe_3O_4 MCNCs从新鲜兔血液中提取基因组DNA比较
2.5 用Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs从大肠杆菌中提取DNA
2.6 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs从金黄色葡萄球菌中提取DNA
2.7 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs从感染绵羊肺炎支原体的肺组织中提取基因组DNA
2.8 PCR检测
3 讨论
第三章 绵羊肺炎支原体环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测方法的建立
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 LAMP检测方法的条件优化
2.2 LAMP-LFD检测方法的建立
2.3 LAMP-LFD检测方法的特异性和重复性试验
2.4 LAMP-LFD灵敏度分析
2.5 临床应用性检测
3 讨论
第四章 绵羊肺炎支原体EF-Tu、Hsp70 蛋白间接ELISA方法的建立
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 pMD18-T-EF-Tu和 pMD18-T-Hsp70 的鉴定
2.2 pET-28a-EF-Tu和 pET-28a-Hsp70 的构建与鉴定
2.3 IPTG最佳诱导条件以及表达形式的确定
2.4 重组蛋白的纯化
2.5 蛋白浓度测定
2.6 重组蛋白Western-blot分析
2.7 间接ELISA方法反应条件的优化
2.8 封闭液的确定以及封闭条件的确定
2.9 一抗最佳孵育时间的确定
2.10 二抗最佳稀释倍数及孵育时间的确定
2.11 阴阳判定临界值标准的确定
2.12 特异性试验
2.13 敏感性试验
2.14 重复性试验
2.15 临床样本检测
3 讨论
全文总结
参考文献
附录
致谢
作者简介
导师评阅表
本文编号：3657326
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