超表达猪源PGC-1α促进小鼠和猪肌纤维类型转变的研究
发布时间：2022-07-14 11:21
多年来对猪选择培育的一个重要目标是提高生长速度和瘦肉率,并已在遗传上改良取得了一定的进展。瘦肉猪的选育使猪肉中酵解型纤维比例增加、肌纤维直径增大、猪肉的嫩度、多汁性、风味,肉色、肌内脂肪和pH值等肉质因素均受到严重影响。研究发现Ⅰ型纤维与肌内脂肪含量,肌肉的嫩度呈正相关；而与纤维直径,pH45MIN,滴水损失呈负相关。ⅡB纤维横切面积大,导致猪肉系水力和剪切力的降低,ⅡB纤维中含有大量的酵解酶,在屠宰后45分钟,肌肉中乳酸和糖原升高,肌肉pH下降,肉色灰白,且系水力低下,滴水损失也与ⅡB型纤维正相关。PGC-1α是细胞能量代谢的关键调控因子,参与调控线粒体的生成,调控线粒体的融合和分裂。小鼠实验显示,骨骼肌中超表达PGC-1α会刺激线粒体的生成,并能促进骨骼肌中ⅡB纤维向Ⅰ型的转变,增加氧化型纤维的比例。因此,本研究以PGC-1α为候选基因,构建肌肉特异性真核表达载体,在构建转基因小鼠模型的基础上,制备转PGC-1α基因的大白猪,研究PGC-1α对猪肌肉中能量代谢,肌肉类型转变,以及猪肉肉质的影响。取得的主要成果如下：1.以真核表达载体pEGFP-Nl为基础,猪BAC文库同源重组的7k...
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 骨骼肌概论
1.1.1 骨骼肌分类
1.1.2 肌肉的组织分布
1.1.3 不同肌肉类型的差异
1.1.4 肌肉的转变
1.2 肌纤维与肉质
1.2.1 肉质性状
1.2.2 肌纤维类型影响猪肉肉质
1.2.3 肌纤维中影响肉质的因素
1.3 PGC-1α研究进展
1.3.1 PGC-1α基因家族结构特征和生物学特性
1.3.2 PGC-1α的生物学功能
1.4 研究的目的与意义
第二章 材料与方法
2.1 主要仪器设备和试剂
2.1.1 主要仪器与设备
2.1.2 主要试剂及耗材
2.1.3 常用化学试剂及其配制
2.1.4 载体
2.1.5 主要分子生物学软件及数据库
2.2 试验方法
2.2.1 p-sMCK-sPGC-1α载体构建及鉴定
2.2.2 转基因小鼠制备与表达检测
2.2.3 猪胚胎成纤维转基因细胞系的建立与检测
2.2.4 转基因猪的制备
2.2.5 转基因猪的初步分子检测
第三章 结果与分析
3.1 p-sMCK-sPGC-1α载体的构建
3.1.1 pMD18-sPGC-1α载体和pEGFP-sMCK载体的双酶切
3.1.2 连接双酶切的产物
3.1.3 p-sMCK-sPGC-1α载体线性化Swa Ⅰ酶切位点的加入
3.1.4 p-sMCK-sPGC-1α载体的PCR鉴定
3.1.5 p-sMCK-sPGC-1α载体的酶切鉴定
3.1.6 序列测定对载体信息的确认
3.2 转基因小鼠的制备及检测鉴定分析
3.2.1 转基因小鼠原代及F1代基因组DNA的PCR检测鉴定
3.2.2 转基因小鼠的Southern Blot分析鉴定
3.2.3 PGC-1α转基因小鼠的肌肉外观形态变化
3.2.4 PGC-1α转基因小鼠骨骼肌中相关基因RNA水平表达分析
3.2.5 转基因小鼠的Western blot检测
3.2.6 小鼠腓肠肌切片ATP酶异染
3.3 30日龄猪胚胎成纤维细胞分离与转染
3.3.1 30日龄猪胚胎成纤维细胞分离
3.3.2 猪胎儿成纤维细胞的p-sMCK-sPGC-1α载体稳转
3.4 体细胞克隆转基因猪的制备及分析
3.4.1 猪阳性成纤维细胞
3.4.2 转PGC-1α载体克隆猪PCR鉴定
3.4.3 转PGC-1α载体克隆猪定量PCR鉴定
3.4.4 转基因猪中PGC-1α拷贝数分析
3.4.5 转基因猪中PGC-1α整合位点分析
3.4.6 转基因猪外观形态变化
3.4.7 转基因猪肌肉中PGC-1α及下游基因RNA水平检测
3.4.8 转基因猪腓肠肌ATP酶染色
3.4.9 转基因猪F1代肉质测定
第四章 讨论
4.1 PGC-1α与肌纤维转变
4.2 PGC-1α与糖代谢脂肪酸氧化
4.3 PGC-1α与线粒体
4.4 PGC-1α与猪肉肉质
第五章 结论
5.1 主要研究成果
5.2 主要创新点
5.3 研究的不足之处
5.4 下一步工作
参考文献
附录
致谢
本文编号：3661029
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
1.1 骨骼肌概论
1.1.1 骨骼肌分类
1.1.2 肌肉的组织分布
1.1.3 不同肌肉类型的差异
1.1.4 肌肉的转变
1.2 肌纤维与肉质
1.2.1 肉质性状
1.2.2 肌纤维类型影响猪肉肉质
1.2.3 肌纤维中影响肉质的因素
1.3 PGC-1α研究进展
1.3.1 PGC-1α基因家族结构特征和生物学特性
1.3.2 PGC-1α的生物学功能
1.4 研究的目的与意义
第二章 材料与方法
2.1 主要仪器设备和试剂
2.1.1 主要仪器与设备
2.1.2 主要试剂及耗材
2.1.3 常用化学试剂及其配制
2.1.4 载体
2.1.5 主要分子生物学软件及数据库
2.2 试验方法
2.2.1 p-sMCK-sPGC-1α载体构建及鉴定
2.2.2 转基因小鼠制备与表达检测
2.2.3 猪胚胎成纤维转基因细胞系的建立与检测
2.2.4 转基因猪的制备
2.2.5 转基因猪的初步分子检测
第三章 结果与分析
3.1 p-sMCK-sPGC-1α载体的构建
3.1.1 pMD18-sPGC-1α载体和pEGFP-sMCK载体的双酶切
3.1.2 连接双酶切的产物
3.1.3 p-sMCK-sPGC-1α载体线性化Swa Ⅰ酶切位点的加入
3.1.4 p-sMCK-sPGC-1α载体的PCR鉴定
3.1.5 p-sMCK-sPGC-1α载体的酶切鉴定
3.1.6 序列测定对载体信息的确认
3.2 转基因小鼠的制备及检测鉴定分析
3.2.1 转基因小鼠原代及F1代基因组DNA的PCR检测鉴定
3.2.2 转基因小鼠的Southern Blot分析鉴定
3.2.3 PGC-1α转基因小鼠的肌肉外观形态变化
3.2.4 PGC-1α转基因小鼠骨骼肌中相关基因RNA水平表达分析
3.2.5 转基因小鼠的Western blot检测
3.2.6 小鼠腓肠肌切片ATP酶异染
3.3 30日龄猪胚胎成纤维细胞分离与转染
3.3.1 30日龄猪胚胎成纤维细胞分离
3.3.2 猪胎儿成纤维细胞的p-sMCK-sPGC-1α载体稳转
3.4 体细胞克隆转基因猪的制备及分析
3.4.1 猪阳性成纤维细胞
3.4.2 转PGC-1α载体克隆猪PCR鉴定
3.4.3 转PGC-1α载体克隆猪定量PCR鉴定
3.4.4 转基因猪中PGC-1α拷贝数分析
3.4.5 转基因猪中PGC-1α整合位点分析
3.4.6 转基因猪外观形态变化
3.4.7 转基因猪肌肉中PGC-1α及下游基因RNA水平检测
3.4.8 转基因猪腓肠肌ATP酶染色
3.4.9 转基因猪F1代肉质测定
第四章 讨论
4.1 PGC-1α与肌纤维转变
4.2 PGC-1α与糖代谢脂肪酸氧化
4.3 PGC-1α与线粒体
4.4 PGC-1α与猪肉肉质
第五章 结论
5.1 主要研究成果
5.2 主要创新点
5.3 研究的不足之处
5.4 下一步工作
参考文献
附录
致谢
本文编号：3661029
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