H5和H7亚型禽流感ELISA抗体检测方法的建立

发布时间：2022-08-11 17:00

　　高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza,HPAI）是由一些H5和H7亚型禽流感病毒引起的高致病性和高死亡率的烈性禽类传染病,对养禽业造成严重的危害,并具有重要的公共卫生学意义。DNA疫苗是可以有效防控禽流感的基因工程疫苗之一,已经获批一类新兽药证书,现地应用需要相应配套的、更敏感的评价和检测方法。因此,本研究拟建立一种比HI方法更为敏感的ELISA方法,为基因工程疫苗的推广应用提供必要的技术支撑。采用杆状病毒表达系统来表达当前主要流行毒株A/Chicken/Guizhou/4/2013（CK/GZ/4/13（H5N1））、A/Duck/Guizhou/S4184/2017（H5N6）（DK/GZ/S4184/2017（H5N6））和A/Chicken/Guangxi/SD098/2017（H7N9）（CK/GX/SD098/17（H7N9））的真核表达HA蛋白。分别以CK/GZ/4/13（H5N1）、CK/GX/SD098/2017（H7N9）和DK/GZ/S4184/2017（H5N6）的HA基因为模板,将目的片段通过PCR扩增克隆至昆虫表... 

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 流感病毒的概述
    1.2 高致病性禽流感的危害
        1.2.1 H5亚型HPAIV的危害
        1.2.2 H7N9亚型HPAI的危害
    1.3 禽流感基因工程疫苗的研究进展
        1.3.1 DNA疫苗的研究进展
        1.3.2 禽流感基因重组活载体疫苗的研究进展
        1.3.3 禽流感基因工程亚单位疫苗的研究进展
    1.4 杆状病毒表达系统的研究进展
    1.5 抗体检测方法的研究进展
        1.5.1 HI方法的概述
        1.5.2 NI方法的概述
        1.5.3 AGP方法的概述
        1.5.4 ELISA方法的研究进展
        1.5.5 全自动免疫发光法的进展
    1.6 本研究的目的和意义
第二章 Clade2.3.4.4 H5亚型禽流感病毒HA蛋白的杆状病毒系统表达
    2.1 材料与方法
        2.1.1 主要实验材料
        2.1.2 重组质粒pFastBac1-GZ4、pFastBac1-S4184 的构建及鉴定
        2.1.3 rBacmid-GZ4、rBacmid-S4184 重组杆粒的构建及鉴定
        2.1.4 重组病毒rBV-GZ4、rBV-S4184 的获得及蛋白表达
        2.1.5 蛋白的大量制备及纯化
    2.2 结果
        2.2.1 重组质粒pFastBac1-GZ4、pFastBac1-S4184 的构建和鉴定
        2.2.2 重组杆粒reBacmid-GZ4、重组杆粒reBacmid-SD098的PCR鉴定
        2.2.3 杆状病毒上清DNA的 PCR鉴定
        2.2.4 间接免疫荧光(IFA)鉴定HA蛋白的表达
        2.2.5 western blot鉴定HA蛋白的表达
        2.2.6 蛋白的大量表达及纯化
    2.3 讨论
第三章 H7亚型禽流感病毒HA蛋白的杆状病毒系统表达
    3.1 材料与方法
        3.1.1 主要实验材料
        3.1.2 重组质粒pFastBac1-SD098的构建
        3.1.3 rBacmid-SD098 重组杆粒的构建及鉴定
        3.1.4 rBV-SD098 重组病毒的获得及蛋白表达
        3.1.5 蛋白的大量制备及纯化
    3.2 结果
        3.2.1 重组质粒pFastBac1-SD098的构建和鉴定
        3.2.2 重组杆粒reBacmid-SD098的鉴定
        3.2.3 杆状病毒上清DNA的 PCR鉴定
        3.2.4 间接免疫荧光(IFA)鉴定目的蛋白的表达
        3.2.5 western blot鉴定目的蛋白的表达
        3.2.6 蛋白的大量制备及纯化
    3.3 讨论
第四章 H5亚型禽流感间接ELISA抗体检测方法的建立
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试验用血清
        4.1.2 试验用试剂
        4.1.3 试验用仪器及耗材
        4.1.4 间接ELISA方法操作程序
        4.1.5 间接ELISA方法工作条件的确定
    4.2 实验结果
        4.2.1 GZ4蛋白与血清的间接ELISA方法工作条件的优化
    4.3 讨论
第五章 H7亚型禽流感间接ELISA抗体检测方法的建立
    5.1 材料与方法
        5.1.1 试验用血清
        5.1.2 试验试剂
        5.1.3 试验用仪器及耗材
        5.1.4 实验方法
    5.2 实验结果
        5.2.1 SD098蛋白与血清的间接ELISA方法的工作浓度的确定
    5.3 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]一种更灵敏的特异性检测H9亚型禽流感抗体的间接ELISA方法的建立[J]. 仉薇,侯力丹,宋洁,张爽,李芸,李晶,孙蕾,范文辉,刘文军.  生物工程学报. 2017(08)
[2]An Overview of the Highly Pathogenic H5N1 Influenza Virus[J]. Jingchuan Yin,Shi Liu,Ying Zhu.  Virologica Sinica. 2013(01)
[3]H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA方法的初步建立[J]. 万春和,刘明,刘春国,张晓霁,杨涛,刘大飞,陈浩,齐金龙,乔传玲.  微生物学报. 2008(02)



本文编号：3675040