牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

发布时间：2022-09-29 14:33

　　为建立一种灵敏、特异、快速的牛巴贝斯虫检测方法,针对牛巴贝斯虫Rap-1a基因设计引物进行PCR扩增,然后构建重组质粒制作标准品,经过优化反应体系、绘制标准曲线,建立了牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR方法,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测,同时利用该方法对37份田间样品进行检测。结果显示:建立的牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程式为y=-3.362×Log（X）+43.32,相关系数R~2=0.999,扩增效率为98.4%。该方法的灵敏度为1.0×10~2 copies/μL,是普通PCR（1.0×10~4 copies/μL）的100倍。该方法对牛双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫等7种常见的牛梨形虫病检测结果均为阴性,组内和组间重复试验的变异系数均小于2.5%,37份田间样品的阳性检出率为67.5%。结果表明,本试验建立的牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于牛巴贝斯虫的诊断,从而为其流行病学调查提供了快速有效的检测方法。 

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 试剂和菌株及主要仪器
    1.2 基因组
    1.3 引物和探针的设计与合成
    1.4 常规PCR扩增
    1.5 标准品重组质粒制备
    1.6 实时荧光定量PCR反应条件优化
    1.7 实时荧光定量PCR标准曲线建立
    1.8 敏感性试验
    1.9 特异性试验
    1.1 0 稳定性试验
    1.1 1 应用性检测
2 结果
    2.1 标准品重组质粒制备及浓度检测
    2.2 标准曲线绘制
    2.3 牛巴贝斯虫Taq Man荧光定量PCR的灵敏度、特异性与稳定性检测
    2.4 应用性检测
3 讨论



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