CRISPR/Cas9敲除技术在重组动物疱疹病毒构建中的初步应用
发布时间：2022-09-29 15:50
CRISPR系统是原核生物的一种获得性免疫系统,近年来随着CRISPR/Cas9研究的不断发展,其基因编辑功能逐渐被应用于各个生物学领域。利用CRISPR/Cas9系统对靶标序列的识别,辅助病毒基因的敲除和重组,可提高新毒株的获得效率。疱疹病毒的基因组为线性双链DNA分子,其中伪狂犬病病毒（PRV）和牛疱疹病毒（BHV）的基因组皆能通过sgRNA引导,而被CRISPR/Cas9系统所编辑,可作为其他病毒基因敲除和重组的模式参考。本研究通过构建含敲除目的基因左右同源臂的重组质粒,当目的基因被Cas9蛋白切开后,利用同源重组原理将目的基因替换为eGFP荧光标记蛋白,从而达到基因敲除的目的,并将纯化得到重组的疱疹病毒进行生物学特性分析,建立了高效构建疱疹病毒重组毒株的技术平台。本论文的主要研究结果如下:1.构建PRV TK-/eGFP+毒株利用聚合酶链式反应（PCR）从PRV Bartha-K61株基因组DNA中扩增含TK启动子的TK基因同源臂左臂和TK基因同源臂右臂,与eGFP基因序列一起,顺序克隆至克隆载体pUC19中,构建重组载体pUC19-...
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
文献综述
第一章 CRISPR/Cas9 技术与疱疹病毒基因敲除的研究进展
1.1 CRISPR概述
1.1.1 CRISPR/Cas9 研究历史
1.1.2 CRISPR/Cas9 系统核心结构
1.1.3 CRISPR/Cas9 技术的应用
1.2 伪狂犬病毒及其重组研究
1.2.1 PRV的国内流行现状
1.2.2 PRV基因组特征
1.2.3 PRV疫苗及重组研究
1.3 牛疱疹病毒I型及其重组研究
1.3.1 BHV的国内流行现状
1.3.2 BHV基因组特征
1.3.3 BHV疫苗及重组研究
1.4 研究目的和意义
试验研究
第二章 CRISPR/Cas9 技术在PRV基因敲除中的应用
2.1 材料
2.1.1 毒种、细胞系和实验动物
2.1.2 菌种和质粒
2.1.3 试剂
2.1.4 培养基及缓冲液配制
2.2 方法
2.2.1 细胞培养及病毒扩增
2.2.2 病毒基因组DNA提取
2.2.3 重组载体构建
2.2.4 sgRNA载体构建
2.2.5 细胞转染
2.2.6 病毒重组
2.2.7 病毒蚀斑纯化
2.2.8 重组病毒纯度测定
2.2.9 重组病毒滴度测定
2.2.10 重组病毒生长曲线测定
2.2.11 重组病毒致病性测定
2.3 结果
2.3.1 重组载体构建
2.3.2 sgRNA载体构建
2.3.3 病毒基因组致病性
2.3.4 TK启动子活性验证
2.3.5 病毒重组
2.3.6 病毒纯化
2.3.7 重组病毒纯度检测
2.3.8 重组病毒生长特性
2.3.9 重组病毒致病性
2.4 讨论
第三章 CRISPR/Cas9 技术在BHV基因敲除中的应用
3.1 材料
3.1.1 毒种、细胞系和实验动物
3.1.2 菌种和质粒
3.1.3 试剂
3.1.4 培养基及缓冲液配制
3.2 方法
3.2.1 细胞培养及病毒扩增
3.2.2 病毒基因组DNA提取
3.2.3 重组载体构建
3.2.4 sgRNA载体构建
3.2.5 病毒重组
3.2.6 病毒蚀斑纯化
3.2.7 重组病毒验证
3.2.8 重组病毒滴度测定
3.2.9 重组病毒生长曲线测定
3.2.10 动物抗体检测
3.3 结果
3.3.1 重组载体构建
3.3.2 sgRNA载体构建
3.3.3 病毒重组
3.3.4 病毒纯化
3.3.5 重组病毒纯度检测
3.3.6 重组病毒生长特性
3.3.7 动物抗体检测
3.4 讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]2012～2017年我国部分地区规模化猪场PRV野毒流行病学调查[J]. 高许雷,郑辉,邹敏,刘爽,刘蕾,范根成,吴发兴. 中国动物传染病学报. 2020(01)
[2]2018年规模化猪场伪狂犬病野毒感染血清流行病学调查[J]. 林文耀,宋庆庆,刘玉梅,王凯,刘国民,黄超. 养猪. 2019(02)
[3]牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-1）免疫逃逸机制研究进展[J]. 杨志元,闻晓波,冉旭华. 黑龙江八一农垦大学学报. 2018(04)
[4]表达PEDV中国变异株S基因重组猪伪狂犬病病毒的构建和纯化[J]. 杨盼盼,吴艳阳,杨东东,高冬生,王川庆,赵军,李存法. 中国兽医学报. 2018(06)
[5]我国规模猪场伪狂犬病流行状况及场间传播风险因素[J]. 张淼洁,夏炉明,黄烨祯. 中国动物检疫. 2017(04)
[6]2012-2014年河南省猪伪狂犬病病毒gE基因和TK基因的遗传变异分析[J]. 李宁,吴志明,闫若潜,赵雪丽,王淑娟,马震原,周兵强,刘毅,张珂. 中国兽医学报. 2016(10)
[7]牛群爆发口腔黏膜溃疡类疾病的实验室诊断[J]. 邢思毅,倪宏波,周玉龙,常春龙,常敬伟,李田田,王士霞. 黑龙江八一农垦大学学报. 2015(04)
[8]猪伪狂犬病病毒载体重组疫苗研究进展[J]. 王林青,郑兰兰,李坤,陈红英,李文增,李坤陶,崔保安. 中国预防兽医学报. 2014(02)
[9]《国家中长期动物疫病防治规划（2012~2020年）》（1）[J]. 特种经济动植物. 2014(02)
[10]表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒BHV-1的构建与鉴定[J]. 任宪刚,薛飞,朱远茂,童光志,王延辉,冯军科,祖立闯,李娇,史鸿飞,高欲燃. 微生物学报. 2009(05)
博士论文
[1]河南省免疫猪场伪狂犬病毒分离株生物学特性研究及gE、TK基因双缺失毒株的构建[D]. 吴凤笋.吉林大学 2018
[2]CRISPR/Cas9技术在伪狂犬病毒研究中的应用[D]. 汤艳东.中国农业科学院 2018
[3]江苏省牛常见呼吸道病毒病流行病学调查及表达BVDV-2 E2基因重组BHV-1疫苗的免疫效果评价[D]. 张信军.扬州大学 2018
[4]伪狂犬病毒IE180和EP0基因的表达调控[D]. 郭洪.华中农业大学 2008
[5]猪瘟伪狂犬病重组病毒活疫苗的研究[D]. 徐志文.四川农业大学 2003
硕士论文
[1]猪伪狂犬病病毒HeN1株全基因组测序与病毒遗传变异分析[D]. 叶超.中国农业科学院 2015
[2]牛传染性鼻气管炎TK/gE基因缺失重组病毒的研究[D]. 定明.华中农业大学 2010
本文编号：3682873
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
文献综述
第一章 CRISPR/Cas9 技术与疱疹病毒基因敲除的研究进展
1.1 CRISPR概述
1.1.1 CRISPR/Cas9 研究历史
1.1.2 CRISPR/Cas9 系统核心结构
1.1.3 CRISPR/Cas9 技术的应用
1.2 伪狂犬病毒及其重组研究
1.2.1 PRV的国内流行现状
1.2.2 PRV基因组特征
1.2.3 PRV疫苗及重组研究
1.3 牛疱疹病毒I型及其重组研究
1.3.1 BHV的国内流行现状
1.3.2 BHV基因组特征
1.3.3 BHV疫苗及重组研究
1.4 研究目的和意义
试验研究
第二章 CRISPR/Cas9 技术在PRV基因敲除中的应用
2.1 材料
2.1.1 毒种、细胞系和实验动物
2.1.2 菌种和质粒
2.1.3 试剂
2.1.4 培养基及缓冲液配制
2.2 方法
2.2.1 细胞培养及病毒扩增
2.2.2 病毒基因组DNA提取
2.2.3 重组载体构建
2.2.4 sgRNA载体构建
2.2.5 细胞转染
2.2.6 病毒重组
2.2.7 病毒蚀斑纯化
2.2.8 重组病毒纯度测定
2.2.9 重组病毒滴度测定
2.2.10 重组病毒生长曲线测定
2.2.11 重组病毒致病性测定
2.3 结果
2.3.1 重组载体构建
2.3.2 sgRNA载体构建
2.3.3 病毒基因组致病性
2.3.4 TK启动子活性验证
2.3.5 病毒重组
2.3.6 病毒纯化
2.3.7 重组病毒纯度检测
2.3.8 重组病毒生长特性
2.3.9 重组病毒致病性
2.4 讨论
第三章 CRISPR/Cas9 技术在BHV基因敲除中的应用
3.1 材料
3.1.1 毒种、细胞系和实验动物
3.1.2 菌种和质粒
3.1.3 试剂
3.1.4 培养基及缓冲液配制
3.2 方法
3.2.1 细胞培养及病毒扩增
3.2.2 病毒基因组DNA提取
3.2.3 重组载体构建
3.2.4 sgRNA载体构建
3.2.5 病毒重组
3.2.6 病毒蚀斑纯化
3.2.7 重组病毒验证
3.2.8 重组病毒滴度测定
3.2.9 重组病毒生长曲线测定
3.2.10 动物抗体检测
3.3 结果
3.3.1 重组载体构建
3.3.2 sgRNA载体构建
3.3.3 病毒重组
3.3.4 病毒纯化
3.3.5 重组病毒纯度检测
3.3.6 重组病毒生长特性
3.3.7 动物抗体检测
3.4 讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]2012～2017年我国部分地区规模化猪场PRV野毒流行病学调查[J]. 高许雷,郑辉,邹敏,刘爽,刘蕾,范根成,吴发兴. 中国动物传染病学报. 2020(01)
[2]2018年规模化猪场伪狂犬病野毒感染血清流行病学调查[J]. 林文耀,宋庆庆,刘玉梅,王凯,刘国民,黄超. 养猪. 2019(02)
[3]牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-1）免疫逃逸机制研究进展[J]. 杨志元,闻晓波,冉旭华. 黑龙江八一农垦大学学报. 2018(04)
[4]表达PEDV中国变异株S基因重组猪伪狂犬病病毒的构建和纯化[J]. 杨盼盼,吴艳阳,杨东东,高冬生,王川庆,赵军,李存法. 中国兽医学报. 2018(06)
[5]我国规模猪场伪狂犬病流行状况及场间传播风险因素[J]. 张淼洁,夏炉明,黄烨祯. 中国动物检疫. 2017(04)
[6]2012-2014年河南省猪伪狂犬病病毒gE基因和TK基因的遗传变异分析[J]. 李宁,吴志明,闫若潜,赵雪丽,王淑娟,马震原,周兵强,刘毅,张珂. 中国兽医学报. 2016(10)
[7]牛群爆发口腔黏膜溃疡类疾病的实验室诊断[J]. 邢思毅,倪宏波,周玉龙,常春龙,常敬伟,李田田,王士霞. 黑龙江八一农垦大学学报. 2015(04)
[8]猪伪狂犬病病毒载体重组疫苗研究进展[J]. 王林青,郑兰兰,李坤,陈红英,李文增,李坤陶,崔保安. 中国预防兽医学报. 2014(02)
[9]《国家中长期动物疫病防治规划（2012~2020年）》（1）[J]. 特种经济动植物. 2014(02)
[10]表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒BHV-1的构建与鉴定[J]. 任宪刚,薛飞,朱远茂,童光志,王延辉,冯军科,祖立闯,李娇,史鸿飞,高欲燃. 微生物学报. 2009(05)
博士论文
[1]河南省免疫猪场伪狂犬病毒分离株生物学特性研究及gE、TK基因双缺失毒株的构建[D]. 吴凤笋.吉林大学 2018
[2]CRISPR/Cas9技术在伪狂犬病毒研究中的应用[D]. 汤艳东.中国农业科学院 2018
[3]江苏省牛常见呼吸道病毒病流行病学调查及表达BVDV-2 E2基因重组BHV-1疫苗的免疫效果评价[D]. 张信军.扬州大学 2018
[4]伪狂犬病毒IE180和EP0基因的表达调控[D]. 郭洪.华中农业大学 2008
[5]猪瘟伪狂犬病重组病毒活疫苗的研究[D]. 徐志文.四川农业大学 2003
硕士论文
[1]猪伪狂犬病病毒HeN1株全基因组测序与病毒遗传变异分析[D]. 叶超.中国农业科学院 2015
[2]牛传染性鼻气管炎TK/gE基因缺失重组病毒的研究[D]. 定明.华中农业大学 2010
本文编号：3682873
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3682873.html
