鸭疫里默氏杆菌OmpA蛋白的免疫原性研究

发布时间：2022-10-29 11:37

　　鸭疫里默氏杆菌（Riemerella antipestifer, RA）能引起鸭、鹅、火鸡等多种禽类发生鸭疫里默氏杆菌感染,呈急性或慢性败血性经过。本研究对RA OmpA基因开展了生物信息学分析、克隆表达、蛋白纯化、多克隆抗体制备、基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立、重组蛋白免疫原性等研究,主要结果如下：1 RA OmpA基因的生物信息学分析RA OmpA全基因长1208bp,由397个氨基酸编码大小为43.52kDa的蛋白,等电点（pI）为4.81。该蛋白没有信号肽切割位点和跨膜区,有如下功能位点：有4个N-糖基化位点,9个蛋白激酶C磷酸化位点,7个酪蛋白激酶II磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点。亚细胞定位分析该蛋白主要分布于外膜和细胞之内。氨基酸进化树分析表明该蛋白与黄杆菌科编码OmpA蛋白的其它成员相似性低。该蛋白的抗原性分析表明第185-337位这段氨基酸有连续而且强烈的抗原性。2 RA OmpA基因的克隆表达和多抗的制备对RA OmpA基因设计了一对引物,大小为1208bp,构建pJET1.2/OmpA克隆载体及其pET32a（+）OmpA表达载体,转入表达菌株BL21... 

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩写词汇及其含义说明
一、引言
    1 鸭疫里默氏杆菌研究概况
    2 OmpA基因编码蛋白的特点
        2.1 OmpA蛋白的结构特点
        2.2 OmpA蛋白的功能
            2.2.1 致病作用
            2.2.2 支撑细胞外膜骨架
            2.2.3 参与生物膜的形成
            2.2.4 作为外源蛋白的表面呈现载体
            2.2.5 免疫原性
    3 OmpA的基因特点
    4 OmpA其它特性
        4.1 中性粒细胞弹性蛋白酶降解外膜蛋白杀灭大肠杆菌
        4.2 膜间质分子伴侣Skp捕获外膜蛋白
        4.3 外膜蛋白参与革兰氏阴性菌对异丙醇耐受的调节
    5 研究的目的和意义
二、试验研究
    1 材料
        1.1 菌株、菌种、质粒、血清和动物
        1.2 试剂
        1.3 主要溶液的配制
            1.3.1 RA基因组提取相关试剂
            1.3.2 基因克隆相关试剂
            1.3.3 基因表达相关试剂
            1.3.4 弗氏不完全佐剂的配制
            1.3.5 Western-blot相关试剂的配制
            1.3.6 ELISA相关溶液的配制
        1.4 主要仪器设备
    2 方法
        2.1 鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的生物信息学分析
        2.2 RA OmpA基因的克隆和表达
            2.2.1 细菌培养及基因组DNA的提取
            2.2.2 RA OmpA基因引物设计与扩增
            2.2.3 DH5 α感受态的制备、重组T克隆质粒pJET1.2/OmpA的构建及鉴定
            2.2.4 原核表达pET-32a(+)/OmpA重组质粒的构建和鉴定
            2.2.5 重组表达质粒pET-32a(+)/OmpA的表达
            2.2.6 OmpA重组表达蛋白诱导条件的优化
        2.3 OmpA重组表达蛋白的纯化及鉴定
            2.3.1 OmpA重组表达蛋白的纯化
            2.3.2 OmpA重组表达蛋白的鉴定
            2.3.3 兔抗重组OmpA蛋白多克隆抗体的制备
            2.3.4 兔抗OmpA IgG的纯化与鉴定
        2.4 基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立
            2.4.1 鸭抗鸭疫里默氏杆菌ATCC株阳性血清的制备
            2.4.2 间接ELISA的基本操作程序
            2.4.3 抗原的最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定
            2.4.4 酶标二抗最佳工作浓度的确定
            2.4.5 酶标二抗作用时间的确定
            2.4.6 阴阳性血清最佳作用时间的确定
            2.4.7 封闭液的确定
            2.4.8 底物最佳作用时间确定
            2.4.9 阴阳性临界值的确定
            2.4.10 重复性试验
            2.4.11 特异性试验
            2.4.12 符合性试验
        2.5 重组表达蛋白的免疫原性研究
            2.5.1 体液免疫水平的检测
            2.5.2 细胞免疫水平的检测
    3 结果
        3.1 鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的生物信息学分析
            3.1.1 RA OmpA蛋白质的组分析
            3.1.2 信号肽切割位点和跨膜区预测
            3.1.3 抗原性分析
            3.1.4 功能位点预测
            3.1.5 蛋白质亚细胞定位分析
            3.1.6 二级结构预测与密码子氨基酸序列保守结构域预测
            3.1.7 密码子偏性分析
            3.1.8 系统进化树分析
        3.2 RA OmpA基因克隆表达、蛋白纯化及抗体制备
            3.2.1 RA OmpA基因的扩增、T克隆及亚克隆的构建
            3.2.2 OmpA基因诱导表达、纯化及Western blot检测重组蛋白
            3.2.3 兔抗RA OmpA抗体效价的检测及抗体IgG的粗提
        3.3 基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立
            3.3.1 抗原的最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定
            3.3.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定
            3.3.3 酶标二抗作用时间的确定
            3.3.4 阴阳性血清最佳作用时间的确定
            3.3.5 封闭液的确定
            3.3.6 底物最佳作用时间确定
            3.3.7 阴阳性临界值的确定
            3.3.8 重复性试验
            3.3.9 特异性试验
        3.4 重组表达蛋白的免疫原性研究
            3.4.1 人工免疫鸭抗体水平监测结果
            3.4.2 细胞因子的检测结果
    4 讨论
        4.1 鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的生物信息学分析
        4.2 RA OmpA基因的克隆表达、蛋白纯化及抗体制备
        4.3 基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立
        4.4 重组表达蛋白的免疫原性研究
三、结论
参考文献
致谢
作者简介及攻读硕士学位期间论文发表



本文编号：3697618