猪IFITM3与口蹄疫病毒VP0蛋白相互作用的研究
发布时间：2023-01-08 14:57
口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是一种人畜共患的急性,热性,高度接触性的病毒性传染病（陈溥言等2009）,主要引起偶蹄类动物发热,四肢、口、舌、鼻和乳房等部位形成水泡和溃烂。口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus, FMDV）基因组为单股正链RNA,可编码12个成熟的病毒蛋白,其中VPO蛋白是病毒的结构蛋白之一,与病毒入侵细胞密切相关。本实验室发现SIFITM3蛋白具有抗病毒效果,为了进一步探索SIFITM3蛋白抑制口蹄疫病毒增殖的机制,本研究利用酵母双杂交、细胞共定位和GST-Pull Down技术验证口蹄疫病毒VPO蛋白与SIFITM3蛋白间的相互作用,并通过缺失突变验证SIFITM3蛋白与口蹄疫病毒VPO蛋白相互作用的关键位点及缺失后的SIFITM3蛋白抗口蹄疫病毒功能的变化,通过杆状病毒表达系统表达SIFITM3蛋白和VP2蛋白（VPO蛋白主要亚基）,为研究蛋白间的直接相互作用奠定基础,主要研究内容如下： 一、FMDVVPO蛋白与SIFITM3蛋白的相互作用 通过PCR扩增FMDV VPO基因和猪源IFI...
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表（Abbreviations)
1 文献综述
1.1 口蹄疫简介
1.2 口蹄疫危害及流行现状
1.3 口蹄疫防治策略
1.4 口蹄疫病毒分子特征
1.4.1 基因组特征
1.4.2 病毒结构特征
1.5 干扰素抗病毒简介
1.6 干扰素诱导跨膜蛋白IFITM家族介绍
1.7 IFITM家族蛋白抑制病毒的机制
1.7.1 不同包膜病毒入侵细胞的机制
1.7.2 IFITM蛋白通过阻止病毒进入过程抑制病毒感染
1.7.3 IFITM蛋白通过阻止病毒粒子进入胞浆抑制病毒感染
1.8 IFITM蛋白在机体内扮演的角色
1.9 酵母双杂交系统简介
1.10 杆状病毒表达系统简介
2 研究目的和意义
3 材料和方法
3.1 材料
3.1.1 细胞和菌株
3.1.2 载体与质粒
3.1.3 工具酶及主要试剂
3.1.4 培养基与抗生素及其配制
3.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.6 其它缓冲液及试剂
3.2 方法
3.2.1 质粒构建
3.2.1.1 限制性内切酶酶切反应
3.2.1.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.1.3 醜切产物回收与纯化
3.2.1.4 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.2.1.6 连接产物的转化
3.2.1.7 质粒的制备与鉴定
3.2.1.7.1 质粒的小量制备（OMEGA小提试剂盒）
3.2.1.7.2 质粒的大量制备（OMEGA大提试剂盒）
3.2.2 酵母中对蛋白互作的验证
3.2.3 荧光共定位实验对蛋白互作的验证
3.2.4 目的蛋白原核表达及包涵体的复性
3.2.5 GST-pull down试验
3.2.6 免疫共沉淀实验对蛋白互作的验证
3.2.7 空斑试验
3.2.8 重组杆状病毒获得
3.3 本研究所使用的引物
4 结果与分析
4.1 sIFITM3与FMDV VP0的相互作用
4.1.1 酵母双杂交验证sIFITM3与FMDV VP0的相互作用
4.1.2 细胞水平验证FMDV VP0与sIFITM3的相互作用
4.2 sIFITM3不同缺失突变对FMDV增殖的影响
4.3 杆状病毒表达FMDV VP2蛋白和sIFITM3蛋白的研究
4.3.1 重组转移载体的构建
4.3.2 重组杆粒的获得与鉴定
4.3.3 重组杆状病毒的获得及表达产物的检测
4.3.4 sIFITM3(1-165 bp)截短蛋白的原核表达及纯化
5 讨论
5.1 sIFITM3蛋白的结构域预测
5.2 sIFITM3蛋白N端胞外区与VP0蛋白在酵母双杂交系统中的互作
5.3 sIFITM3蛋白与VP0蛋白相互作用位点的研究
5.4 sIFITM3转染BHK细胞对FMDV在细胞上增殖的影响
5.5 sIFITM3基因与VP2基因重组杆状病毒的构建及蛋白表达
6 结论
参考文献
致谢
本文编号：3728681
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表（Abbreviations)
1 文献综述
1.1 口蹄疫简介
1.2 口蹄疫危害及流行现状
1.3 口蹄疫防治策略
1.4 口蹄疫病毒分子特征
1.4.1 基因组特征
1.4.2 病毒结构特征
1.5 干扰素抗病毒简介
1.6 干扰素诱导跨膜蛋白IFITM家族介绍
1.7 IFITM家族蛋白抑制病毒的机制
1.7.1 不同包膜病毒入侵细胞的机制
1.7.2 IFITM蛋白通过阻止病毒进入过程抑制病毒感染
1.7.3 IFITM蛋白通过阻止病毒粒子进入胞浆抑制病毒感染
1.8 IFITM蛋白在机体内扮演的角色
1.9 酵母双杂交系统简介
1.10 杆状病毒表达系统简介
2 研究目的和意义
3 材料和方法
3.1 材料
3.1.1 细胞和菌株
3.1.2 载体与质粒
3.1.3 工具酶及主要试剂
3.1.4 培养基与抗生素及其配制
3.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.6 其它缓冲液及试剂
3.2 方法
3.2.1 质粒构建
3.2.1.1 限制性内切酶酶切反应
3.2.1.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3.2.1.3 醜切产物回收与纯化
3.2.1.4 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.2.1.6 连接产物的转化
3.2.1.7 质粒的制备与鉴定
3.2.1.7.1 质粒的小量制备（OMEGA小提试剂盒）
3.2.1.7.2 质粒的大量制备（OMEGA大提试剂盒）
3.2.2 酵母中对蛋白互作的验证
3.2.3 荧光共定位实验对蛋白互作的验证
3.2.4 目的蛋白原核表达及包涵体的复性
3.2.5 GST-pull down试验
3.2.6 免疫共沉淀实验对蛋白互作的验证
3.2.7 空斑试验
3.2.8 重组杆状病毒获得
3.3 本研究所使用的引物
4 结果与分析
4.1 sIFITM3与FMDV VP0的相互作用
4.1.1 酵母双杂交验证sIFITM3与FMDV VP0的相互作用
4.1.2 细胞水平验证FMDV VP0与sIFITM3的相互作用
4.2 sIFITM3不同缺失突变对FMDV增殖的影响
4.3 杆状病毒表达FMDV VP2蛋白和sIFITM3蛋白的研究
4.3.1 重组转移载体的构建
4.3.2 重组杆粒的获得与鉴定
4.3.3 重组杆状病毒的获得及表达产物的检测
4.3.4 sIFITM3(1-165 bp)截短蛋白的原核表达及纯化
5 讨论
5.1 sIFITM3蛋白的结构域预测
5.2 sIFITM3蛋白N端胞外区与VP0蛋白在酵母双杂交系统中的互作
5.3 sIFITM3蛋白与VP0蛋白相互作用位点的研究
5.4 sIFITM3转染BHK细胞对FMDV在细胞上增殖的影响
5.5 sIFITM3基因与VP2基因重组杆状病毒的构建及蛋白表达
6 结论
参考文献
致谢
本文编号：3728681
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3728681.html
