东北地区野生鸟类主要禽免疫抑制病病原感染情况调查及与REV PR相互作用宿主蛋白的筛选
发布时间：2023-01-09 13:47
近年来,禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus, REV）与J-亚群禽白血病病毒（Avian Leukosis virus subgroup J, ALV-J）、鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus, CAV）和马立克氏病病毒（Marek’s disease virus, MDV）等几种免疫抑制性病毒的混合感染在养鸡场中普遍存在,使得鸡群免疫力低下,导致针对禽流感、新城疫等重要疫病的疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。其中,有3大病毒性肿瘤病之称的禽白血病（AL）、禽网状内皮组织增生症（RE）和马立克氏病（MD）对禽类健康的危害甚为严重。针对上述病原的分子流行病学研究主要集中于家禽和水禽,很少有关野生鸟类的调查报道,且目前对野生鸟类携带病原的研究主要集中在禽流感病毒和新城疫病毒,国内外尚未见有关野生鸟类禽免疫抑制病病原的流行病学调查报道。野生鸟类作为许多病原携带者和自然宿主,可潜在传播人和动物的重要传染病。随着候鸟的迁徙,携带某些病毒的候鸟可能会将病毒传播到不同的地方而导致疾...
【文章页数】：104 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 课题背景
1.2 REV病原学、分子病毒学及流行情况
1.2.1 病原学
1.2.2 基因结构及编码蛋白
1.2.3 流行病学
1.2.4 REV的危害
1.3 ALV-J病原学、分子病毒学及流行情况
1.3.1 ALV病毒亚型分类
1.3.2 ALV-J基因结构及编码蛋白
1.3.3 ALV-J流行病学研究
1.4 野鸟在动物病毒传播中的作用及意义
1.5 蛋白相互作用研究方法
1.5.1 酵母双杂交技术
1.5.2 噬菌体展示技术
1.5.3 免疫共沉淀技术
1.5.4 Pulldown 技术
1.5.5 荧光共振能量转移
1.6 Snapin蛋白研究概况
1.7 本研究的目的和意义
2 东北地区野生鸟类禽免疫抑制病病原感染情况调查
2.1 实验材料和实验仪器
2.1.1 病料、病毒和细胞
2.1.2 菌株、载体
2.1.3 主要试剂及试剂盒
2.1.4 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 样品采集及处理
2.2.2 病毒基因组DNA和RNA提取
2.2.3 禽免疫抑制病病原的特异性PCR检测
2.2.4 野鸟源REV分离及gp90基因遗传演化分析
2.2.5 野鸟源ALV-J分离及gp85基因遗传演化分析
2.3 结果
2.3.1 禽免疫抑制病病原PCR检测结果
2.3.2 野鸟源REV分离鉴定
2.3.3 野鸟源REV gp90基因序列分析及遗传演化分析
2.3.4 DBYR1102全基因组克隆及序列分析
2.3.5 野鸟源ALV-J分离鉴定
2.4 讨论
3 REV p30蛋白的表达纯化及ELISA检测方法的初步建立
3.1 材料
3.1.1 病毒株、质粒、菌株和实验动物
3.1.2 主要试剂及仪器
3.2 方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 DNA的提取及p30基因的扩增
3.2.3 重组表达质粒的构建与鉴定
3.2.4 重组蛋白的诱导表达与鉴定
3.2.5 重组蛋白的纯化与浓缩
3.2.6 融合蛋白的Western blot鉴定
3.2.7 抗REV-p30基因多克隆抗体的制备及生物学活性检测
3.2.8 间接ELISA检测方法的初步建立
3.2.9 间接ELISA检测方法的初步应用
3.3 结果
3.3.1 REVp30蛋白的原核表达及蛋白纯化
3.3.2 重组p30蛋白的表达与鉴定
3.3.3 重组蛋白纯化与浓缩
3.3.4 融合蛋白Western blot鉴定
3.3.5 多克隆抗体的制备及检测
3.3.6 融合蛋白的间接ELISA检测结果
3.4 讨论
4 酵母双杂交筛选与REV聚合酶PR相互作用的宿主蛋白
4.1 材料
4.1.1 毒株、细胞、文库、抗体及质粒
4.1.2 主要仪器
4.1.3 主要试剂、耗材
4.1.4 毒株、细胞、文库、抗体及质粒主要培养基及培养液配制
4.2 方法
4.2.1 PR 诱饵载体的构建
4.2.2 pGBK-PR诱饵载体自激活性与毒性检测
4.2.3 酵母双杂交筛选
4.2.4 酵母共转化试验
4.2.5 酵母菌转化
4.2.6 Snapin真核表达载体构建
4.3 实验结果
4.3.1 PR-pGBKT7诱饵质粒的构建
4.3.2 pGBPR诱饵质粒自激活性与毒性检测
4.3.3 文库滴度检测
4.3.4 杂交效率检测
4.3.5 回转验证实验结果
4.3.6 Snapin基因的扩增与酶切鉴定
4.3.7 PR真核表达质粒酶切鉴定
4.4 讨论
4.4.1 文库构建与质量鉴定
4.4.2 诱饵质粒构建与检测
4.4.3 文库筛选
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]安徽省五华鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因分子序列特征分析[J]. 戴银,赵瑞宏,胡晓苗,张丹俊,夏松林,盛昌树,杨文超,钟国发. 中国畜牧兽医. 2013(11)
[2]黄羽肉鸡J亚群禽白血病肿瘤及相关病变发生规律的研究[J]. 张丹俊,赵瑞宏,沈学怀,段世鹏,胡晓苗,戴银,潘孝成,侯宏艳,周学利,朱传民. 中国家禽. 2013(20)
[3]髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒四川株SCGS-1的分离鉴定及前病毒cDNA重组质粒的构建[J]. 林艳,赵扬,夏静,邹年丽,文心田,曹三杰,黄勇. 中国兽医学报. 2013(08)
[4]禽白血病J亚型病毒分离鉴定及其gp85基因克隆表达[J]. 李广兴,杨婷,潘龙,任晓峰,王秀荣. 东北农业大学学报. 2013(06)
[5]广西主要地方优良品种鸡禽白血病的感染情况调查[J]. 冷毕丹,吴元俊,秦丽莉,王培坤,韦平. 广西畜牧兽医. 2013(03)
[6]J亚群禽白血病病毒感染鸡的抗原和血清抗体变化规律[J]. 杭柏林,尹丽萍,孙薇薇,梁有志,钱琨,金文杰,邵红霞,秦爱建. 中国家禽. 2013(02)
[7]J亚群禽白血病病毒分离株HLJ09SH01株感染性克隆的构建及其致病性研究[J]. 纪晓琳,王琦,高玉龙,王永强,秦立廷,祁小乐,高宏雷,王笑梅. 中国预防兽医学报. 2013(01)
[8]进口海兰褐祖代鸡禽白血病感染状态的持续观察及与国内发病鸡群种蛋p27检出率、病毒分离率的相关性[J]. 王丽,李传龙,赵鹏,李德庆,张青婵,李中明,崔治中. 中国兽医学报. 2013(01)
[9]兰州市及周边地区禽白血病病毒的分子流行病学调查[J]. 管宏伟,吴润,刁小龙,罗鹏,张莉,何轶群,艾文娜. 中国兽医科学. 2012(12)
[10]蛋鸡J亚群禽白血病病毒SD1009分离株的分离鉴定及全基因组序列分析[J]. 王琦,王永强,康忠惠,高玉龙,潘伟,李久宽,秦立廷,祁小乐,高宏雷,王笑梅. 中国预防兽医学报. 2011(08)
博士论文
[1]蛋鸡ALV-J的分离鉴定及分子致瘤机制的研究[D]. 曲悦.山东农业大学 2012
[2]商品蛋鸡源J亚群禽白血病病毒分离株生物学特性研究[D]. 吴晓平.扬州大学 2010
[3]鸡贫血病毒结构蛋白抗原表位研究及感染性克隆构建[D]. 王晓艳.中国农业科学院 2007
本文编号：3729293
【文章页数】：104 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
1.1 课题背景
1.2 REV病原学、分子病毒学及流行情况
1.2.1 病原学
1.2.2 基因结构及编码蛋白
1.2.3 流行病学
1.2.4 REV的危害
1.3 ALV-J病原学、分子病毒学及流行情况
1.3.1 ALV病毒亚型分类
1.3.2 ALV-J基因结构及编码蛋白
1.3.3 ALV-J流行病学研究
1.4 野鸟在动物病毒传播中的作用及意义
1.5 蛋白相互作用研究方法
1.5.1 酵母双杂交技术
1.5.2 噬菌体展示技术
1.5.3 免疫共沉淀技术
1.5.4 Pulldown 技术
1.5.5 荧光共振能量转移
1.6 Snapin蛋白研究概况
1.7 本研究的目的和意义
2 东北地区野生鸟类禽免疫抑制病病原感染情况调查
2.1 实验材料和实验仪器
2.1.1 病料、病毒和细胞
2.1.2 菌株、载体
2.1.3 主要试剂及试剂盒
2.1.4 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 样品采集及处理
2.2.2 病毒基因组DNA和RNA提取
2.2.3 禽免疫抑制病病原的特异性PCR检测
2.2.4 野鸟源REV分离及gp90基因遗传演化分析
2.2.5 野鸟源ALV-J分离及gp85基因遗传演化分析
2.3 结果
2.3.1 禽免疫抑制病病原PCR检测结果
2.3.2 野鸟源REV分离鉴定
2.3.3 野鸟源REV gp90基因序列分析及遗传演化分析
2.3.4 DBYR1102全基因组克隆及序列分析
2.3.5 野鸟源ALV-J分离鉴定
2.4 讨论
3 REV p30蛋白的表达纯化及ELISA检测方法的初步建立
3.1 材料
3.1.1 病毒株、质粒、菌株和实验动物
3.1.2 主要试剂及仪器
3.2 方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 DNA的提取及p30基因的扩增
3.2.3 重组表达质粒的构建与鉴定
3.2.4 重组蛋白的诱导表达与鉴定
3.2.5 重组蛋白的纯化与浓缩
3.2.6 融合蛋白的Western blot鉴定
3.2.7 抗REV-p30基因多克隆抗体的制备及生物学活性检测
3.2.8 间接ELISA检测方法的初步建立
3.2.9 间接ELISA检测方法的初步应用
3.3 结果
3.3.1 REVp30蛋白的原核表达及蛋白纯化
3.3.2 重组p30蛋白的表达与鉴定
3.3.3 重组蛋白纯化与浓缩
3.3.4 融合蛋白Western blot鉴定
3.3.5 多克隆抗体的制备及检测
3.3.6 融合蛋白的间接ELISA检测结果
3.4 讨论
4 酵母双杂交筛选与REV聚合酶PR相互作用的宿主蛋白
4.1 材料
4.1.1 毒株、细胞、文库、抗体及质粒
4.1.2 主要仪器
4.1.3 主要试剂、耗材
4.1.4 毒株、细胞、文库、抗体及质粒主要培养基及培养液配制
4.2 方法
4.2.1 PR 诱饵载体的构建
4.2.2 pGBK-PR诱饵载体自激活性与毒性检测
4.2.3 酵母双杂交筛选
4.2.4 酵母共转化试验
4.2.5 酵母菌转化
4.2.6 Snapin真核表达载体构建
4.3 实验结果
4.3.1 PR-pGBKT7诱饵质粒的构建
4.3.2 pGBPR诱饵质粒自激活性与毒性检测
4.3.3 文库滴度检测
4.3.4 杂交效率检测
4.3.5 回转验证实验结果
4.3.6 Snapin基因的扩增与酶切鉴定
4.3.7 PR真核表达质粒酶切鉴定
4.4 讨论
4.4.1 文库构建与质量鉴定
4.4.2 诱饵质粒构建与检测
4.4.3 文库筛选
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]安徽省五华鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因分子序列特征分析[J]. 戴银,赵瑞宏,胡晓苗,张丹俊,夏松林,盛昌树,杨文超,钟国发. 中国畜牧兽医. 2013(11)
[2]黄羽肉鸡J亚群禽白血病肿瘤及相关病变发生规律的研究[J]. 张丹俊,赵瑞宏,沈学怀,段世鹏,胡晓苗,戴银,潘孝成,侯宏艳,周学利,朱传民. 中国家禽. 2013(20)
[3]髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒四川株SCGS-1的分离鉴定及前病毒cDNA重组质粒的构建[J]. 林艳,赵扬,夏静,邹年丽,文心田,曹三杰,黄勇. 中国兽医学报. 2013(08)
[4]禽白血病J亚型病毒分离鉴定及其gp85基因克隆表达[J]. 李广兴,杨婷,潘龙,任晓峰,王秀荣. 东北农业大学学报. 2013(06)
[5]广西主要地方优良品种鸡禽白血病的感染情况调查[J]. 冷毕丹,吴元俊,秦丽莉,王培坤,韦平. 广西畜牧兽医. 2013(03)
[6]J亚群禽白血病病毒感染鸡的抗原和血清抗体变化规律[J]. 杭柏林,尹丽萍,孙薇薇,梁有志,钱琨,金文杰,邵红霞,秦爱建. 中国家禽. 2013(02)
[7]J亚群禽白血病病毒分离株HLJ09SH01株感染性克隆的构建及其致病性研究[J]. 纪晓琳,王琦,高玉龙,王永强,秦立廷,祁小乐,高宏雷,王笑梅. 中国预防兽医学报. 2013(01)
[8]进口海兰褐祖代鸡禽白血病感染状态的持续观察及与国内发病鸡群种蛋p27检出率、病毒分离率的相关性[J]. 王丽,李传龙,赵鹏,李德庆,张青婵,李中明,崔治中. 中国兽医学报. 2013(01)
[9]兰州市及周边地区禽白血病病毒的分子流行病学调查[J]. 管宏伟,吴润,刁小龙,罗鹏,张莉,何轶群,艾文娜. 中国兽医科学. 2012(12)
[10]蛋鸡J亚群禽白血病病毒SD1009分离株的分离鉴定及全基因组序列分析[J]. 王琦,王永强,康忠惠,高玉龙,潘伟,李久宽,秦立廷,祁小乐,高宏雷,王笑梅. 中国预防兽医学报. 2011(08)
博士论文
[1]蛋鸡ALV-J的分离鉴定及分子致瘤机制的研究[D]. 曲悦.山东农业大学 2012
[2]商品蛋鸡源J亚群禽白血病病毒分离株生物学特性研究[D]. 吴晓平.扬州大学 2010
[3]鸡贫血病毒结构蛋白抗原表位研究及感染性克隆构建[D]. 王晓艳.中国农业科学院 2007
本文编号：3729293
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