猪流行性腹泻病毒河北地方株的分离鉴定及其遗传进化分析

发布时间：2023-02-07 08:03

　　猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。该病主要危害哺乳仔猪,5日龄内的仔猪感染后死亡率可达100%。目前该病主要的防治方法是疫苗免疫,但是自2010年PED在中国再次暴发以来,疫苗免疫效果不佳,无法给猪群提供保护,给我国养猪业带来巨大损失。已有的研究发现PEDV变异是疫苗失效的主要原因,因此研究地方毒株的组织培养特性及遗传进化具有重要意义。本研究采集河北省规模养猪场腹泻仔猪的小肠及肠内容物,经RT-PCR检测,将阳性病料过滤处理后,接种于Vero细胞盲传,结果直至第5代出现典型病变;进一步经RT-PCR检测、间接免疫荧光试验和透射电镜观察后,最终证实成功分离到PEDV,将其命名为HBQHD1株。参照PEDV AJ1102株的全基因序列,设计16对引物,对HBQHD1株全基因组进行测定。提取HBQHD1株的RNA模板,经RT-PCR扩增后,得到16个片段目的基因,经克隆、测序、拼接后,得到HBQHD1株的全基因序列,并将其提交至NCBI,GenBank登陆号为MK606368.1。HBQHD1株基因组全长28038bp,经与25株具有...

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
缩略词
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 猪流行性腹泻病毒
        1.1.1 PEDV的理化特性
        1.1.2 PEDV的培养特性
        1.1.3 PEDV的基因结构
        1.1.4 编码的蛋白结构及功能
    1.2 PED的流行病学
    1.3 PED的病理变化和临床症状
    1.4 PED的诊断技术
        1.4.1 中和试验
        1.4.2 免疫荧光法
        1.4.3 酶联免疫吸附试验
        1.4.4 胶体金免疫层析法
    1.5 PEDV疫苗的研究
        1.5.1 灭活疫苗
        1.5.2 弱毒疫苗
        1.5.3 核酸疫苗
        1.5.4 转基因植物疫苗
        1.5.5 基因工程疫苗
        1.5.6 亚单位疫苗
    1.6 防治
    1.7 研究的目的与意义
第二章 河北省PEDV流行株的分离鉴定
    2.1 试验材料
        2.1.1 病料
        2.1.2 细胞及毒株
        2.1.3 主要试剂耗材
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 试剂配制
        2.1.6 引物设计与合成
    2.2 试验步骤
        2.2.1 病料的采集与处理
        2.2.2 RNA的提取
        2.2.3 RT-PCR检测
        2.2.4 胰酶浓度测定
        2.2.5 PEDV在 Vero细胞上增殖
        2.2.6 PEDV分离株间接免疫荧光(IFA)鉴定
        2.2.7 病毒粒子透射电镜观察
    2.3 结果与分析
        2.3.1 RT-PCR检测
        2.3.2 最佳胰酶浓度测定
        2.3.3 病毒的分离和传代
        2.3.4 间接免疫荧光试验
        2.3.5 病毒形态的电镜观察
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 全基因组序列的测定与遗传进化分析
    3.1 试验材料
        3.1.1 毒株、菌种及载体
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 试剂配制
        3.1.5 引物设计与合成
    3.2 试验方法
        3.2.1 病毒处理
        3.2.2 RNA提取
        3.2.3 RT-PCR
        3.2.4 PEDV全基因组扩增
        3.2.5 PCR产物纯化
        3.2.6 DNA连接转化
        3.2.7 重组质粒鉴定
        3.2.8 序列测定与拼接
        3.2.9 全基因组序列分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 全基因扩增结果
        3.3.2 全基因片段克隆及拼接
        3.3.3 HBQHD1株基因组结构分析
        3.3.4 HBQHD1株S蛋白的遗传进化分析
        3.3.5 HBQHD1株M蛋白的遗传进化分析
        3.3.6 HBQHD1株N蛋白的遗传进化分析
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 结论
参考文献
参加科研情况说明
致谢



本文编号：3736712