禽病原性大肠杆菌neuC基因突变株的构建和突变株中λRed系统引入抗性的去除及其致病性的研究

发布时间：2023-02-13 14:31

　　禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一种常见的局部或全身性感染的细菌性传染病,包括大肠杆菌性肉芽肿、腹膜炎、输卵管炎、脐炎、滑膜炎、气囊炎、眼炎、卵黄性腹膜炎等疾病,随着集约化养禽业的发展,给养禽业带来严重的经济损失。 荚膜多糖是禽致病性大肠杆菌的重要的致病因了,能够保护机体免受宿主免疫系统的侵害,neuC是荚膜多糖区域二的基因,neuC基因的缺失会使荚膜在合成方面产生缺陷。 本研究利用λ-Red同源重组的方法构建了E058△neuC::cat、E058△neuC基因缺失突变株,同时将带有相应启动子的neuC全基因和完整的“意外转录本”插入表达载体pGEX-6P-1中,构建相应的回复株。PCR扩增出带有酶切位点的neuC基因并将其插入到pMD(?)19-Tsimple vector载体中,筛选出阳性重组子pMD-T-neuC,然后运用分子克隆方法将chlormycetin (cat)抗性基因插入到目的基因neuC中,构建出带有chlormycetin抗性基因质粒pMD-neuC-Cat。PCR扩增neu...

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
综述
    第一部分 禽源性大肠杆菌的研究进展
        1. 大肠杆菌病概述
        2. 潜在致病因了研究
            2.1 禽大肠杆菌的优势血清型
            2.2 脂多糖(LPS)
            2.3 黏附素(Adhesin)
                2.3.1 Ⅰ型菌毛黏附素
                2.3.2 P型菌毛黏附素
                2.3.3 Curli菌毛黏附素
            2.4 荚膜
            2.5 温度敏感性血凝素(temperature-sensitive hemagglutinin,Tsh)
            2.6 铁摄取系统
            2.7 外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)
            2.8 侵袭素(IbeA)
        3. APEC的致病机理
    第二部分 λRed重组技术的应用展望
        1. λRed重组系统的作用机制
        2. λRed重组系统的应用前景展望
    参考文献
前言
1 材料
    1.1 囷株和质粒
    1.2 主要试剂
    1.3 主要仪器
    1.4 分子生物学及数据分析软件
    1.5 试验鸡
2 方法
    2.1 T-neuC-Cat重组质粒的构建
        2.1.1 neuC基因的扩增
        2.1.2 neuC基因的克隆
        2.1.3 将抗性基因克隆入重组质粒
    2.2 E05SAneuC::cat突变株的构建以及？i Red重组系统引入抗性的去除
        2.2.1 感受态细胞的制备及转化
            2.2.1.1 电转化感受态细胞的制备
            2.2.1.2 质粒pKD46的转化
            2.2.1.3 质粒pKD46功能的诱导和感受态细胞的制备
            2.2.1.4 电转化
            2.2.1.5 质粒pKD46的消除
        2.2.2 氯霉素抗性基因的去除
            2.2.2.1 质粒pCP20电转入突变株E058△neuC::cat
                2.2.2.1.1 电转化感受态细胞的制备
                2.2.2.1.2 质粒pCP20的转化
                2.2.2.1.3 质粒pCP20的消除
    2.3 RT-PCR
        2.3.1 细菌RNA的提取
        2.3.2 DNA的去除反应
        2.3.3 反转录反应
        2.3.4 cDNA的PCR鉴定
    2.4 neuC突变株的回复拯救试验及“意外转录本”的回复拯救试验
        2.4.1 neuC完整基因片段及“意外转录本”的扩增
        2.4.2 重组质粒pGEX-6p-1neuC和pGEX-6p-1 neuC'的构建
        2.4.3 电转化受体菌获得回复拯救株
    2.5 突变株的生物学特性的研究
        2.5.1 细菌生长曲线的测定
        2.5.2 12日龄SPF鸡胚的致死率试验
        2.5.3 1日龄雏鸡致死性试验
        2.5.4 SPF鸡血清的杀菌性实验
        2.5.5 HD11细胞的吞噬实验
        2.5.6 体内分布试验
3 结果
    3.1 neuC片段及neuC片段克隆入pMD(?)19-T载体中的鉴定
    3.2 Chloramphenicol抗性基因的获得
    3.3 重组质粒T-neuC-Cat的构建
    3.4 突变株的构建与鉴定
        3.4.1 DNA片段的准备及电转化
        3.4.2 突变株E058△neuC::cat的PCR鉴定结果
        3.4.3 去抗性突变株E058△neuC的PCR鉴定结果
    3.5 RT-PCR结果
        3.5.1 突变株E058△neuC::cat、E058△neuC的RT-PCR鉴定结果
            3.5.1.1 突变株E058△neuC::cat的RT-PCR鉴定结果
            3.5.1.2 去抗性突变株E058△neuC的RT-PCR鉴定结果
    3.6 回复株的构建及鉴定结果
    3.7 生长曲线结果
        3.7.1 E058及突变株E058△neuC::cat、E058△neuC的生长曲线
    3.8 SPF鸡胚的致死率试验结果
    3.9 1日龄雏鸡致死性试验
    3.10 血清杀菌试验结果
    3.11 细胞吞噬试验结果
    3.12 35日龄SPF鸡体内动态分布试验结果
4 讨论
全文总结
参考文献
致谢



本文编号：3741893