两株缺失SORF3/TK基因重组鸭肠炎病毒的构建及其基本生物学特性研究

发布时间：2023-03-10 19:41

　　鸭病毒性肠炎(duck viral enteritis，DVE)，又名鸭瘟(duck plague，DP)，是鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病，曾相继在多个国家和地区流行，给养鸭业造成巨大的经济损失。本病病原为鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)，亦称鸭疱疹病毒1型(Anatid herpesvirus1)，在2011年第九次病毒分类报告(ICTV)中，将其划分为疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科马立克病毒属。 根据本实验室克隆DEV C-KCE株US区序列和TK序列设计引物，扩增同源臂基因，将左右同源臂基因克隆至pEASY-blunt simple和pMD18-T simple载体，构建pEASY-S3和pMD18T-TK载体。将表达盒插入pEASY-S3、pMD18-T-TK两同源臂构建缺失病毒转移载体pEASY-S3-gpt-EGFP、pMD18-T-TK-gpt。将重组载体与DEV感染细胞的总DNA共转染次代鸭胚成纤维细胞(DEF)，利用霉酚酸(MPA)加压，8代筛选、富集和纯化，得到重组病毒，经PCR、IIF鉴定正确，命名为DEV-ΔS3...

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 鸭病毒性肠炎概述
        1.1.1 临床症状与病理剖检
        1.1.2 诊断
        1.1.3 鸭病毒性肠炎的防治
    1.2 鸭肠炎病毒研究进展
        1.2.1 DEV 的生物学特性
        1.2.2 DEV 的分子生物学特性
        1.2.3 鸭肠炎病毒 SORF3 基因和 TK 基因的研究进展
    1.3 疱疹病毒载体研究进展
        1.3.1 基因缺失疫苗
        1.3.2 重组活载体疫苗
    1.4 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 试验动物
        2.1.2 质粒、载体、菌株、和毒株
        2.1.3 主要试剂及抗体
        2.1.4 主要仪器
    2.2 重组病毒转移载体的构建
        2.2.1 重组病毒转移载体的构建策略
        2.2.2 引物设计与合成
        2.2.3 病毒核酸的提取
        2.2.4 同源臂的扩增
        2.2.5 PCR 产物的克隆与转化
        2.2.6 重组阳性质粒的筛选与鉴定
        2.2.7 左、右同源臂连接
        2.2.8 pMD18-T-gpt-EGFP 和 pMD18-T-gpt 表达盒的构建
        2.2.9 缺失病毒转移载体的构建
    2.3 重组病毒的构建与筛选
        2.3.1 重组转移载体质粒的大量制备
        2.3.2 DEV 全基因组与重组转移载体质粒共转染
        2.3.3 重组病毒的筛选及纯化
    2.4 重组病毒的鉴定
        2.4.1 引物设计与合成
        2.4.2 重组病毒的 PCR 鉴定
        2.4.3 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 基因表达产物的间接免疫荧光检测
    2.5 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 生物学特性的基本研究
        2.5.1 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 的理化特性分析
        2.5.2 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 的体外稳定性分析
        2.5.3 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 与亲本病毒生长曲线的绘制
        2.5.4 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 与亲本病毒蚀斑直径大小的比较
    2.6 动物试验
        2.6.1 免疫分组
        2.6.2 DEV 病毒的超离纯化
        2.6.3 咽及泄殖腔棉拭子中基因的检测
        2.6.4 间接 ELISA 方法检测鸭血清中抗体消长规律
        2.6.5 中和抗体效价的测定
        2.6.6 病理组织学变化
3 结果与分析
    3.1 重组病毒转移载体的构建
        3.1.1 重组病毒同源臂基因的扩增
        3.1.2 表达盒基因的获得
        3.1.3 重组质粒的鉴定
        3.1.4 左、右同源臂连接结果
        3.1.5 缺失病毒转移载体的构建
        3.1.6 pMD18T-gpt-EGFP 的连接结果
    3.2 重组病毒的构建与筛选
    3.3 重组病毒的鉴定
        3.3.1 重组病毒 DEV-ΔS3 的 PCR 鉴定
        3.3.2 重组病毒 DEV-ΔTK 的 PCR 鉴定
        3.3.3 重组病毒的 IIF 检测
    3.4 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 生物学特性的基本研究
        3.4.1 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 的理化特性分析
        3.4.2 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 的体外稳定性分析
        3.4.3 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 生长曲线的绘制
        3.4.4 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 与亲本病毒蚀斑直径大小的比较
    3.5 动物试验
        3.5.1 咽及泄殖腔棉拭子中基因的检测
        3.5.2 间接 ELISA 方法检测鸭血清中抗体消长规律
        3.5.3 中和抗体效价的测定
        3.5.4 病理组织学变化
4 讨论
    4.1 DEV 缺失病毒的构建
        4.1.1 构建 DEV 缺失病毒的意义
        4.1.2 缺失位点的选择
        4.1.3 重组病毒筛选方法的选择
    4.2 重组病毒的鉴定
    4.3 重组病毒 DEV-ΔS3/DEV-ΔTK 生物学特性的基本研究
    4.4 动物试验结果的分析
        4.4.1 重组病毒的安全性
        4.4.2 血清抗体效价的测定
        4.4.3 中和抗体效价的测定
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士期间发表的论文



本文编号：3758445