牦牛IGF-Ⅱ干扰载体的构建及其转染对睾丸支持细胞的影响

发布时间：2023-04-03 19:08

　　旨在构建干扰胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-Ⅱ, IGF-Ⅱ)的重组质粒载体,研究IGF-Ⅱ对牦牛睾丸支持细胞的影响。本研究设计并合成针对牦牛IGF-Ⅱ的shRNA寡核苷酸,并将其克隆至pLKO.1质粒载体上,转染牦牛睾丸支持细胞后经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞株,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测IGF-Ⅱ基因和蛋白的表达,采用细胞生长分析仪分析支持细胞的增殖凋亡情况。结果显示,干扰牦牛IGF-Ⅱ表达的pLKO.1质粒载体构建成功,其可在睾丸支持细胞中稳定表达,且能有效抑制IGF-Ⅱ基因的表达。与对照组相比,pLKO.1-shRNA2的干扰效率最显著,IGF-Ⅱ的表达量下调至19.1%(P<0.05),且pLKO.1-shRNA2可使内源性IGF-Ⅱ蛋白的表达量减少76.3%(P<0.05)。pLKO.1-shRNA2质粒转染及筛选得到的稳定细胞株培养48 h后的细胞分裂增殖活性显著低于对照组(P<0.05)。qRT-PCR结果显示,干扰内源性IGF-Ⅱ后,睾丸支持细胞中的IGF-Ⅰ和IGF-ⅡR基因...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 主要仪器与试剂
    1.2 牦牛支持细胞的分离与培养
    1.3 pLKO.1-shRNA-IGF-II载体的构建
    1.4 牦牛睾丸支持细胞的转染
    1.5 qRT-PCR检测干扰效率
    1.6 Western blotting检测IGF-II蛋白的表达
    1.7 细胞生长检测
    1.8 数据统计与分析
2 结 果
    2.1 pLKO.1-shRNA-IGF-II载体的构建及鉴定
    2.2 qRT-PCR检测干扰效率
    2.3 Western blotting检测IGF-II蛋白表达
    2.4 牦牛睾丸支持细胞生长检测
    2.5 干扰IGF-II对支持细胞内IGFs等相关基因的影响
3 讨 论
4 结 论



本文编号：3780979