嗜吞噬细胞无形体msp2、msp4蛋白的原核表达及免疫原性研究

发布时间：2023-04-11 18:38

　　嗜吞噬细胞无形体是经蜱传播的专性的革兰氏阴性小球杆菌，还是重要的人兽共患病病原体，不仅可以感染人，也可以感染牛羊反刍动物，及马和狗等家养动物。自20世纪90年代初于美国首次发现以来，澳洲、欧洲多国、韩国及我国先后均有报道，且近年来呈上升趋势。由于该病的临床多表现为急性不明原因发热，肌肉痛，乏力，头痛等类似病毒感染性疾病症状，临床缺乏对该病的足够认识，也缺乏相应的快速诊断方法，因此该病及易发生误诊，严重时可导致多器官功能衰竭，甚至死亡，所以对该病的确诊就要结合实验室检测进行诊断，目前应用于实验室检测方法主要有IFA、急性期的血液涂片检查、巢氏PCR、直接对病原的分离培养。但是免疫荧光方法（IFA）不仅需要特殊仪器如荧光显微镜，还需要等到恢复期采集第二次血液标本。病原体分离培养诊断十分可靠，但分离率低且耗时。以PCR为基础的分子生物学技术可以取代分离培养进行病原体检测，但需要特殊的仪器及具备一定实验室经验的人员才能完成。因此开发一种简便的灵敏性的高特异性的检测方法对于该病原体的诊断是很有必要的。 嗜吞噬细胞无形体的OMP1/MSP2/P44蛋白超家族是无形体的特征性的蛋白家族，该家族基因包...

【文章页数】：93 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
英文摘要
英文缩略词表
第一篇 综述
    1 病原分类学
    2 病原及基因组特点
    3 嗜吞噬细胞无形体的入侵机制
    4 传播媒介及宿主动物
    5 流行病学
    6 临床症状及治疗
    7 诊断和实验室检测
        7.1 临床症状
        7.2 直接鉴定
        7.3 PCR检测和病原分离培养
        7.4 血清学诊断
        7.5 病理学诊断
    8 P44/msp2蛋白
第二篇 实验研究
    实验一 msp2、msp4蛋白全长中信号肽对原核表达的影响
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 序列来源及菌株
                1.1.2 主要仪器设备
            1.2 方法
                1.2.1 质粒转化
                1.2.2 阳性表达菌BL21（DE3）鉴定
                1.2.3 阳性表达菌的诱导表达
            1.3 pET28a表达载体的构建及表达菌的诱导
                1.3.1 三个重组的pET32a质粒与pET28a（+）空载体酶切
                1.3.2 目的片段与pET-28a大片段连接
                1.3.3 连接产物转化表达菌BL21（DE3）
                1.3.4 pET28a阳性重组表达菌的鉴定
                1.3.5 阳性表达菌的诱导表达
            1.4 pGEX-4T-1表达载体的构建和表达菌的诱导
            1.5 E-msp2、N-msp4、Z-msp4的信号肽分析
        2 实验结果
            2.1 合成的三个表面蛋白全长基因的pET32a载体酶切鉴定
            2.2 重组质粒pET32a（+）诱导表达情况
            2.3 重组质粒pET28a（+）表达载体的酶切鉴定
            2.4 重组质粒pET28a（+）诱导表达情况
            2.5 重组质粒pGEX-4T-1表达载体的酶切鉴定
            2.6 重组质粒pGEX-4T-1诱导表达情况
            2.7 信号肽分析结果
        3 讨论
            3.1 信号肽对原核蛋白表达的影响
            3.2 跨膜区对原核蛋白表达的影响
            3.3 稀有密码子对原核蛋白表达的影响
    实验二 嗜吞噬细胞无形体msp2、msp4蛋白的生物信息学分析及表达纯化
        摘要
        1 方法和材料
            1.1 材料
                1.1.1 菌株和试剂
                1.1.2 主要仪器设备
            1.2 实验方法
                1.2.1 msp2、msp4蛋白的生物信息学分析
                1.2.2 引物设计
                1.2.3 原核表达载体构建
                1.2.4 蛋白的诱导表达
                1.2.5 重组蛋白的表达形式分析
                1.2.6 重组蛋白表达条件的优化
                1.2.7 Western-blot分析
                1.2.8 重组蛋白的纯化
                1.2.9 纯化后的重组蛋白的浓度测定（BCA法）
        2 结果
            2.1 msp2、msp4蛋白的生物信息学分析结果
                2.1.1 ProtParam工具分析结果
                2.1.2 SOPMA预测msp2、msp4蛋白的二级结构
                2.1.3 msp2、msp4蛋白的跨膜区预测结果
                2.1.4 msp2、msp4蛋白的亲水性预测结果
                2.1.5 msp2、msp4蛋白的抗原表位分析
            2.2 原核表达载体的构建
            2.3 小量蛋白诱导表达
            2.4 重组蛋白的表达形式分析
            2.5 蛋白的诱导条件的优化
                2.5.1 不同浓度下IPTG对蛋白表达的影响
                2.5.2 低温条件下对蛋白的表达形式的影响
            2.6 蛋白的纯化
            2.7 WesternBlot
        3 讨论
    实验三 重组msp2、msp4蛋白的免疫原性研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 主要试剂
                1.1.2 主要血清
                1.1.3 主要仪器
                1.1.4 实验动物
                1.1.5 主要试剂的配制
            1.2 方法
                1.2.1 重组蛋白的多抗的制备
                1.2.2 小鼠抗体水平的测定-ELISA
                1.2.3 间接ELISA最佳工作条件的的确定
        2 结果
            2.1 小鼠抗体水平的测定
            2.2 ELISA工作条件的确定
                2.2.1 抗原包被的最佳浓度和待检血清最佳稀释倍数的确定
                2.2.2 最适封闭液的和封闭时间的确定
                2.2.3 酶标二抗最佳工作浓度的确定
                2.2.5 底物作用时间的确定
                2.2.6 cut-off值的确定
                2.2.7 特异性试验
                2.2.8 灵敏性试验
                2.2.9 重复性试验
                2.2.10 临床样品检测
        3 讨论
第三篇 实验结论
参考文献
附件
致谢
作者简介及在研究生期间主要参与的研究项目、发表文章
石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表



本文编号：3789568