两种基因亚型新城疫病毒体外感染细胞和人工感染鸽的固有免疫应答差异的研究

发布时间：2023-05-06 04:00

　　鸽新城疫(Newcastle disease,ND)又被称为鸽瘟,是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)变异株鹤 Ⅰ 型副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus type 1,PPMV-1)引起的一种急性传染病,该病是危害养鸽业的主要疾病之一,给养鸽业造成很大的经济损失。目前我国鸽群中暴发新城疫呈上升的趋势,而对鸽源NDV所引起的固有免疫相关因子的研究相对较少,因此非常有必要从固有免疫水平上研究对鸽有宿主特异性的基因Ⅵb亚型和国内主要流行基因Ⅶd亚型鸽源NDV对宿主固有免疫相关因子的表达,为进一步了解鸽源NDV的致病性提供宿主方面的信息,对防控鸽NDV感染具有重要意义。本研究分别设计合成了鸡的诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、IFNβ、IFNγ和鸽的IFNγ、iNOS、MDA5、IL-2等固有免疫相关因子的特异性引物,通过克隆纯化构建质粒标准品,构建鸡的iNOS、IFNβ、IFNγ和鸽的 IFNγ、iNOS、MDA5、IL-2 荧光定量 RT-PCR(qRT-PCR)标准曲线。结果显示,所建立的标准曲线扩增效率均介于92%～102%之间,线性相...

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要英文缩写词
第一章 文献综述
    1.1 禽Ⅰ型副粘病毒简述
        1.1.1 NDV的致病性
        1.1.2 NDV的理化性质
        1.1.3 NDV的血凝活性
        1.1.4 NDV的培养特性
    1.2 机体的免疫系统概述
    1.3 鸽的固有免疫概述
        1.3.1 鸽的固有免疫细胞
        1.3.2 鸽的细胞因子简介
    1.4 模式识别受体(PRRs)
        1.4.1 模式识别受体与病原相关分子模式简介
        1.4.2 Toll样受体简介
    1.5 本课题研究的目的和意义
第二章 禽固有免疫相关因子qRT-PCR标准曲线的建立
    2.1 材料
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 主要试剂及仪器
        2.1.3 主要试剂
    2.2 试验方法
        2.2.1 引物的设计及合成
        2.2.2 细胞总RNA的提取及其cDNA的合成
        2.2.3 目的基因的RT-PCR扩增
        2.2.4 阳性克隆株的鉴定及序列测定
        2.2.5 质粒标准品的制备
        2.2.6 qRT-PCR标准曲线的建立
        2.2.7 敏感性及重复性试验
    2.3 试验结果
        2.3.1 细胞因子RT-PCR结果
        2.3.2 质粒浓度及拷贝数结果
        2.3.3 实时荧光定量RT-PCR标准曲线的建立
        2.3.4 溶解曲线分析
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 两种基因亚型鸽源NDV体外感染CEF和PEF引起固有免疫应答差异的研究
    3.1 材料
        3.1.1 病毒及试验材料
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 病毒的复繁
        3.2.2 原代鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备
        3.2.3 原代鸽胚成纤维细胞(PEF)的制备
        3.2.4 不同基因亚型鸽源NDV的TCID₅₀测定
        3.2.5 细胞的培养与收集
        3.2.6 总RNA提取及反转录
        3.2.7 实时荧光定量RT-PCR检测病毒载量
        3.2.8 实时荧光定量RT-PCR检测检测固有免疫相关基因表达的研究
    3.3 试验结果
        3.3.1 两株NDV的生物学特性
        3.3.2 实时荧光定量RT-PCR检测检测病毒载量结果
        3.3.3 实时荧光定量RT-PCR检测检测固有免疫相关基因表达的研究
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 不同基因亚型鸽源NDV人工感染对鸽固有免疫相关因子基因表达的研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 病毒
        4.1.2 试验动物
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 主要试验仪器
    4.2 方法
        4.2.1 动物试验
        4.2.2 样品的采集及处理
        4.2.3 样品总RNA的提取
            4.2.3.1 样品总RNA的反转录
        4.2.4 两种館源NDV的病毒ELD₅₀的测定方法
        4.2.5 不同基因亚型鸽源NDV人工感染非免疫鸽后血清抗体水平的变化及脾脏病毒载量变化的检测
        4.2.6 不同基因亚型鸽源NDV体内感染对固有免疫相关基因mRNA转录水平的检测
        4.2.7 数据处理及分析
    4.3 试验结果
        4.3.1 临床症状及剖检病变
        4.3.2 ELD₅₀测定结果
        4.3.3 不同基因亚型鸽源NDV人工感染鸽后血清H1抗体水平
        4.3.4 不同基因亚型鸽源NDV人工感染非免疫鸽组织病理变化结果
        4.3.5 不同基因亚型鸽源NDV人工感染非免疫鸽后脾脏和胰腺的病毒载量结果
        4.3.6 不同基因亚型鸽源NDV人工感染固有免疫相关通路关键分子mRNA转录水平
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 结论
参考文献
致谢
个人简历
攻读学位期间发表论文情况



本文编号：3808986