绵羊FHL2基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

发布时间：2023-05-07 07:53

　　为了利用绵羊卵巢酵母双杂交cDNA文库筛选与FHL2蛋白相互作用的宿主蛋白,构建重组诱饵载体pGBKT7-FHL2,试验从绵羊卵巢组织中提取总RNA并反转录为cDNA,依据FHL2基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增FHL2目的片段,连接到经限制性内切酶EocRⅠ和BamHⅠ酶切后的酵母空载体pGBKT7上,并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,进行PCR鉴定及测序比对分析,将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-FHL2转化到酵母Y2HGlod感受态细胞中,利用酵母双杂交系统检测其表达情况、自激活活性及细胞毒性。结果表明:PCR扩增出大小约为876 bp的目的条带;成功构建出重组诱饵载体pGBKT7-FHL2,测序结果与NCBI中预测的FHL2碱基序列同源性为100%;重组诱饵载体pGBKT7-FHL2可在酵母Y2HGold感受态细胞中表达FHL2蛋白,对酵母Y2HGold感受态细胞无自激活活性和毒性作用。说明试验成功构建出重组诱饵载体pGBKT7-FHL2,通过检测证明该重组诱饵载体能够用于酵母双杂交系统筛选互作蛋白。

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【文章目录】：
1 材料
    1.1 样本和菌株
    1.2 主要试剂
    1.3 主要仪器
2 方法
    2.1 引物的设计与合成
    2.2 FHL2基因的PCR扩增及重组诱饵载体pGBKT7-FHL2的构建
    2.3 重组诱饵载体pGBKT7-FHL2转化至酵母Y2HGold 感受态细胞
    2.4 FHL2诱饵蛋白表达的检测
    2.5 重组诱饵载体pGBKT7-FHL2对报告基因自激活活性的检测
    2.6 重组诱饵载体pGBKT7-FHL2对酵母Y2HGold感受态细胞毒性的检测
3 结果与分析
    3.1 FHL2基因的PCR扩增
    3.2 重组诱饵载体pGBKT7-FHL2的构建
    3.3 重组诱饵载体pGBKT7-FHL2转化至酵母Y2HGold 感受态细胞
    3.4 FHL2诱饵蛋白表达的检测
    3.5 重组诱饵载体pGBKT7-FHL2对报告基因自激活活性的检测
    3.6 重组诱饵载体pGBKT7-FHL2对酵母Y2HGold感受态细胞毒性的检测
4 讨论与结论



本文编号：3810594