MEV VP2截短片段可溶性表达及单克隆抗体制备

发布时间：2023-06-08 22:44

　　水貂细小病毒(MEV)也称水貂细小肠炎病毒,主要引起水貂剧烈腹泻,有时伴有呕吐,是危害我国养貂业的主要疾病之一,对养貂业造成了巨大的经济损失。加拿大学者Schofield首次发现本病。目前该病还没有切实有效的治疗手段,预防以疫苗接种为主。因此,我们开展了水貂细小肠炎病毒主要抗原保护性蛋白VP2抗原表位富集区的克隆、原核表达与纯化,以及单克隆抗体制备,在此基础上,研制出可以用于水貂细小病毒感染初期快速诊断的ELISA试剂盒。 VP2蛋白是MEV主要结构蛋白,也是病毒衣壳的主要组分,暴露在衣壳蛋白表面,是诱导机体产生中和抗体的主要靶蛋白。本实验通过蛋白质分析软件分析水貂细小病毒VP2基因上的主要抗原位点,针对编码的主要抗原位点设计了三对特异性引物,分别扩增Loop1、Loop2、Loop3基因,然后将克隆的基因插入到表达载体pET-32a中,转化到BL21(DE3)PLysS表达菌,IPTG诱导表达,超声处理后10000rpm离心,进行SDS-PAGE电泳,结果表明截短的三条VP2基因均获得了较好的可溶性表达,尤其是Loop3基因可溶性效果最好,表达的重组蛋白大小约为32KDa左右,其中目...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
第1章 水貂细小病毒概述
    1.1 水貂细小病毒病原学特征
        1.1.1 MEV的形态及理化特性
        1.1.2 MEV的血凝性
        1.1.3 MEV的抗原性
        1.1.4 MEV的培养特性
    1.2 水貂细小病毒的分子生物学特性
        1.2.1 MEV基因组特征
        1.2.2 MEV编码的蛋白质
    1.3 水貂病毒性肠炎研究进展
        1.3.1 水貂病毒性肠炎的流行病学
        1.3.2 水貂病毒性肠炎的临床症状及病理变化
        1.3.3 水貂细小病毒的诊断方法
        1.3.4 水貂细小病毒的防治措施
    1.4 单克隆抗体研究进展
        1.4.1 鼠源单克隆抗体
        1.4.2 人源单克隆抗体
        1.4.3 基因工程单克隆抗体
第2章 水貂细小病毒VP2基因片段表达
    2.1 试验材料
        2.1.1 毒株、载体、菌种
        2.1.2 主要试剂和仪器
        2.1.3 主要溶液的配制
    2.2 试验方法
        2.2.1 水貂细小病毒DNA的提取
        2.2.2 引物设计
        2.2.3 目的片段的回收
        2.2.4 VP2目的片段与PMD18-T载体连接
        2.2.5 连接产物的转化
        2.2.6 重组质粒的鉴定
        2.2.7 质粒双酶切鉴定
        2.2.8 重组质粒pET32a-Loop1、pET32a-Loop2、pET32a-Loop3的构建
        2.2.9 重组蛋白的原核表达
        2.2.10 重组蛋白的纯化及鉴定
        2.2.11 间接ELISA检测重组蛋白的抗原性
    2.3 结果与分析
        2.3.1 PCR扩增
        2.3.2 重组基因鉴定
        2.3.3 重组蛋白表达质粒的构建及鉴定
        2.3.4 重组质粒的测序结果
        2.3.5 重组蛋白诱导表达条件的优化
        2.3.6 重组蛋白过柱纯化
        2.3.7 间接ELISA对重组蛋白抗原性的鉴定
    2.4 讨论
第3章 MEV VP2基因特异性单克隆抗体制备
    3.1 材料和方法
        3.1.1 细胞系和菌株
        3.1.2 主要试剂和材料
        3.1.3 主要试剂配制
        3.1.4 病毒的增殖和浓缩
        3.1.5 动物免疫
        3.1.6 间接ELISA检测方法的优化
        3.1.7 细胞融合
            3.1.7.1 制备饲养细胞
            3.1.7.2 制备脾细胞
        3.1.8 骨髓瘤细胞SP2/0处理
        3.1.9 脾细胞与骨髓瘤细胞融合
        3.1.10 融合细胞培养
    3.2 阳性孔杂交瘤细胞筛选
        3.2.1 杂交瘤细胞亚克隆化
        3.2.2 杂交瘤细胞的扩大培养
        3.2.3 杂交瘤细胞的冻存
        3.2.4 杂交瘤细胞的复苏
    3.3 单克隆抗体腹水的制备
        3.3.1 腹水单克隆抗体的纯化浓缩
    3.4 单克隆抗体鉴定
        3.4.1 特异性试验鉴定
        3.4.2 单克隆抗体效价及浓度测定
        3.4.3 抗体浓度的测定
    3.5 结果与分析
        3.5.1 ELISA反应体系优化
            3.5.1.1 包被原浓度的确定
            3.5.1.2 封闭液浓度的确定
            3.5.1.3 酶标二抗稀释浓度的确定
        3.5.2 融合细胞小鼠选取
        3.5.3 阳性细胞筛选
        3.5.4 腹水抗体效价测定
        3.5.5 腹水单克隆抗体特异性检测
    3.6 讨论
参考文献
致谢



本文编号：3832643