绵羊精子冷冻前后相关蛋白筛选与基因表达量检测

发布时间：2023-06-17 21:22

　　杜泊绵羊作为优质的肉用品种深受养殖业青睐,但由于在日常生产中绵羊冷冻精液的受胎率普遍偏低制约了杜泊等优秀品种及其冻精产品的推广与普及。冷冻过程会给精子带来一系列影响及损伤,有研究表明冷冻会使精子的结构和功能发生改变,损伤头部的质膜以及顶体,尾部的鞭毛和轴丝等结构,这些影响和损伤可能是导致冷冻精子受胎率偏低的部分原因。但目前对于冷冻精液质量相关的研究大多集中在冻融形态学变化、改善外部储存条件及优化保护剂配比等方面,对于精子冷冻后受胎率下降的内在机制研究尚不深入。随着蛋白组学研究方法的不断进步,为深入研究精子冷冻后受胎率下降的内在机制带了新的机遇。本实验将提取到的鲜精、冻精总蛋白进行SDS-PAGE电泳,将差异明显的蛋白条带通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行鉴别,共得到489种蛋白,通过参考相关文献、生信分析(质谱结果分析、GO分析、KEGG分析)等方法筛选出几种可能与绵羊冷冻精子质量相关的蛋白,并对其基因进行相对表达量测定。本实验的研究目的在于为今后进一步揭示绵羊精子冷冻凋亡或损伤的内在机制提供部分理论依据。1.分别对冻精与鲜精进行精子活率测定,利用伊红活体染色联合低渗肿胀实验...

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 杜泊绵羊简介
    1.2 精子
        1.2.1 精液的组成
        1.2.2 精子结构
        1.2.3 精子发生
    1.3 精液冻存的原理
    1.4 冷冻精子的研究进展
    1.5 精子冻融前后形态学变化以及精子质量的评定指标
        1.5.1 冻融前后的形态学变化
        1.5.2 精子质量的评定指标
    1.6 蛋白组学研究方法
        1.6.1 质谱技术
    1.7 精子质量相关蛋白
        1.7.1 微管蛋白(Tubulin)
        1.7.2 外周致密纤维蛋白(Outer dense fiber)
        1.7.3 筑丝蛋白(Tektins)
        1.7.4 己糖激酶(Hexokinase)
    1.8 本研究的主要内容以及目的
    1.9 技术路线(图2)
2 冻精、鲜精差异蛋白的研究
    2.1 实验试剂与仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 实验动物及样品采集
        2.2.2 冷冻精液的制备及解冻
            2.2.2.1 冷冻精子的制备
            2.2.2.2 冷冻精子解冻
        2.2.3 精子质量的测定
            2.2.3.1 精子活率测定
            2.2.3.2 伊红活体染色联合低渗肿胀实验测定精子质膜完整性
        2.2.4 精子的纯化
        2.2.5 冻精、鲜精总蛋白的提取
            2.2.5.1 溶液配制
            2.2.5.2 实验步骤
        2.2.6 蛋白浓度的测定(Solarbio BCA蛋白浓度测定试剂盒)
        2.2.7 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
            2.2.7.1 实验准备
            2.2.7.2 操作步骤
        2.2.8 蛋白胶条切取
        2.2.9 胶条FASP酶解
        2.2.10 LC-MS/MS检测及质谱结果分析
        2.2.11 蛋白组学分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 精子质量测定结果
            2.3.1.1 精子活率测定结果
            2.3.1.2 精子质膜完整性测定
        2.3.2 精子浓度测定结果
        2.3.3 SDS-PAGE电泳结果及胶条切取
        2.3.4 质谱分析结果
        2.3.5 鉴定到蛋白的GO注释(图9)
        2.3.6 鉴定到蛋白的Kegg Pathway富集(图10)
        2.3.7 冻融精子质量相关蛋白的筛选
3 冻精、鲜精差异基因表达量的研究
    3.1 实验试剂与仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 冻精、鲜精总RNA的提取
        3.2.2 冻精组、鲜精组PCR模板的制备
        3.2.3 PCR引物合成
        3.2.4 梯度PCR检测退火温度及引物特异性
        3.2.5 荧光定量PCR测定精子冻融前后质量相关基因相对表达量
    3.3 小结
        3.3.1 RNA完整性检测结果
        3.3.2 退火温度摸索及引物特异性检测结果
        3.3.3 精子冷冻前后质量差异相关基因相对表达量检测结果
4 讨论
    4.1 冷冻后微管蛋白含量降低造成细胞损伤
    4.2 冷冻后精子运动能力下降
        4.2.1 精子尾部相关蛋白下调导致精子运动能力下降
        4.2.2 精子能量代谢相关蛋白下调导致精子运动能力下降
致谢
参考文献
作者简介



本文编号：3834163