山羊诱导性多能干细胞的研究

发布时间：2023-06-17 21:56

　　通过向体细胞中导入特定的转录因子可以将体细胞重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。已经有很多物种成功地产生相应的iPSCs,但是在有蹄类家畜中,尤其是山羊,iPSCs建系成功的却很少。本研究主要目的是通过慢病毒携带人源的四个多能基因hOCT4,hSOX2,hKLF4和hcMYC-导入山羊体细胞,通过对诱导体系和培养体系的优化,成功将山羊体细胞重编程为iPSCs(giPSCs),在此基础上,使用同样的方法将克隆奶山羊体细胞重编程为iPSCs(tgiPSCs),并且将tgiPSCs作为供体细胞通过核移植技术,检测其能否在体外生产克隆胚胎。本文主要研究结果如下： 1.摸索出适合山羊iPSCs的诱导体系和培养体系 本试验在前人研究成果的基础上,首先使用干细胞无血清培养体系"KNOCKOUT-DMEM+KSR"分别添加人源白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),人源Beta-成纤维细胞生长因子(Beta-fibroblast growth factor,(3-FGF),以及两者都加。试验结果...

【文章页数】：116 页

【学位级别】：博士

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目录
摘要
ABSTRACT
缩略语中英文对照
前言
第一部分 文献综述
    第一章 体细胞重编程的方法及作用机制
        1 引言
        2 体细胞通过核移植进行重编程
        3 体细胞与干细胞融合进行重编程
        4 细胞通过体外培养自发重编程
        5 转染特异性转录因子进行重编程
    第二章 诱导性多能干细胞研究进展
        1 引言
        2 iPSCs的重编程方法
        3 不同来源的供体细胞对重编程效果的影响
        4 重编程的机制
        5 iPSCs的筛选方式
        6 外源多能因子的作用
            6.1 OCT4的作用
            6.2 SOX2的作用
            6.3 cMYC的作用
            6.4 KLF4的作用
            6.5 NANOG的作用
            6.6 LIN28的作用
        7 iPSCs的应用价值
            7.1 消除阻碍干细胞研究的伦理问题
            7.2 克服ESCs应用中存在的免疫排斥反应
            7.3 已经取得的研究成果
        8 iPSCs存在的问题
            8.1 具有一定的致癌性
            8.2 重编程的效率低
            8.3 以病毒为载体的安全性问题
            8.4 来源于多能干细胞的组织在移植后存活率低
    第三章 诱导性多能干细胞与畜牧业生产
        1 引言
        2 ESCs与畜牧业生产
            2.1 生产克隆动物
            2.2 生产转基因动物
        3 偶蹄类家畜iPSCs研究进展
            3.1 猪iPSCs研究现状
            3.2 牛iPSCs研究现状
            3.3 羊iPSCs研究现状
第二部分 试验部分
    第四章 山羊iPSCs诱导及培养体系的建立
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 试验动物
            2.2 细胞株
            2.3 试剂耗材及溶液配制
            2.4 试验仪器
            2.5 试验方法
        3 试验结果
            3.1 羊耳成纤维细胞的形态学观察
            3.2 细胞生长曲线分析
            3.3 细胞核型分析
            3.4 质粒质量检测
            3.5 病毒质量检测
            3.6 山羊iPSCs培养条件
            3.7 山羊iPSCs诱导和培养
        4 讨论
            4.1 体细胞的原代培养与生物学特性分析
            4.2 山羊iPSCs诱导体系的优化
            4.3 山羊iPSCs培养体系的优化
            4.4 克隆的挑取和扩增
            4.5 山羊iPSCs形态学特征
    第五章 山羊iPSCs的鉴定
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 细胞株
            2.2 试剂耗材及溶液配制
            2.3 试验仪器
            2.4 试验方法
        3 试验结果
            3.1 细胞核型
            3.2 碱性磷酸酶检测
            3.3 山羊iPSCs多能基因表达分析
            3.4 山羊iPSCs多能性相关蛋白表达分析
            3.5 山羊iPSCs在体外形成类胚体
            3.6 山羊iPSCs在体内形成畸胎瘤
        4 讨论
            4.1 山羊iPSCs形态学分析
            4.2 山羊iPSCs多能性相关基因表达的检测
            4.3 山羊iPSCs的在体内和体外的分化潜能鉴定
            4.4 山羊iPSCs核型的鉴定
    第六章 克隆羊和转基因克隆羊iPSCs诱导和鉴定
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 试验动物
            2.2 细胞株
            2.3 试剂耗材及溶液配制
            2.4 试验仪器
            2.5 试验方法
        3 试验结果
            3.1 不同来源克隆奶山羊耳成纤维细胞生长曲线分析
            3.2 细胞转基因鉴定
            3.3 山羊iPSCs形态学分析
            3.4 细胞核型分析
            3.5 碱性磷酸酶检测
            3.6 山羊iPSCs多能蛋白表达
            3.7 山羊iPSCs在体外形成类胚体
            3.8 TgiPSCs在体内形成畸胎瘤
        4 讨论
            4.1 TgiPSCs诱导和鉴定
            4.2 TgiPSCs核型分析
    第七章 GiPSCs,克隆山羊iPSCs和tgiPSCs诱导差异
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 细胞株
            2.2 试剂耗材及溶液配制
            2.3 试验仪器
            2.4 试验方法
        3 试验结果
            3.1 不同来源山羊耳成纤维细胞和病毒感染后细胞生长曲线分析
            3.2 不同来源山羊耳成纤维细胞重编程产生克隆效率和克隆质量的差异
            3.3 不同山羊iPSCs内源多能基因表达差异
        4 讨论
            4.1 TgiPSCs重编程效率的分析
            4.2 TgiPSCs和giPSCs生物学特征的比较
    第八章 转基因克隆奶山羊来源的IPSCS参与核移植胚胎的发育
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 细胞株
            2.2 试剂耗材及溶液配制
            2.3 试验仪器
            2.4 试验方法
        3 试验结果
            3.1 不同来源的供体细胞对克隆胚胎融合率和卵裂率的影响
            3.2 giPSCs,tgiPSCs以及vivo-embryos内源性多能基因表达差异
            3.3 TgFs和tgiPSCs核移植胚IGF家族基因表达的影响
            3.4 对tgFs,tgiPSCs和tgiPSCs来源的畸胎瘤进行PCR检测
        4 讨论
            4.1 GiPSCs和tgiPSCs重编程效果的分析
            4.2 TgiPSCs对核移植胚胎发育的影响
参考文献
全文结论
创新点和进一步研究的课题
攻读博士学位期间发表的学术论文
致谢



本文编号：3834213