猪圆环病毒2型Cap标记蛋白的重组杆状病毒表达研究

发布时间：2023-07-24 22:41

　　猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是一种无囊膜的小型单链环状DNA病毒,病毒粒子为17 nm左右。PCV分为猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)。与PCV2相关的一系疾病,如断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等称PCVD。PCVD给养猪业造成的危害重大,至今疫苗免疫仍然是防控PCV2的主要手段。国内PCV2疫苗主要为灭活苗,价格偏高,且难以将猪体内已感染的PCV2彻底清除,所诱导产生抗体不能与野毒抗体相区别。因此,研发高效廉价的,所诱导产生的抗体能与野毒抗体相区分的亚单位疫苗具有重要意义。PCV2的ORF2编码233或234个氨基酸残基构成的PCV2 Cap蛋白是PCV2的唯一结构蛋白,也是主要免疫原性蛋白(Mankertz A et al.,1998),Cap蛋白已被研制成PCV2亚单位疫苗使用。本研究致力于构建能表达携带标记的PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒,所获得的标记蛋白可为PCV2亚单位疫苗的研究提供素材:1.PCV2 GZ-RH1株ORF2生物信息学分析及Flag表位标签的引入为了解PCV2 GZ-R...

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 猪圆环病毒研究进展
        1.1 病原学
        1.2 流行病学
        1.3 PCVD的防治及疫苗研究状况
            1.3.1 商品化PCV2疫苗
            1.3.2 新型疫苗的研发
    2 昆虫细胞杆状病毒表达系统
        2.1 杆状病毒载体
            2.1.1 杆状病毒
            2.1.2 杆状病毒载体的构建
        2.2 昆虫细胞培养
        2.3 昆虫细胞杆状病毒表达系统的应用
    3 V5与Flag表位标签概述
    4 研究目的及意义
第二章 PCV2 ORF2基因的生物信息学分析及Flag表位标签的引入
    1 材料
        1.1 PCV2基因组核苷酸序列
        1.2 生物信息学软件及网络数据库
        1.3 菌株、毒株及主要试剂
        1.4 实验主要仪器设备
    2 方法
        2.1 特异性引物
        2.2 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因分析
        2.3 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因编码的氨基酸分析
        2.4 PCV2 GZ-RH1株的ORF2基因密码子偏好性分析
        2.5 pMD19-T-PCV2质粒的构建及鉴定
            2.5.1 病毒DNA的提取
            2.5.2 感受态细胞的制备
            2.5.3 pMD19-T-PCV2质粒的构建
        2.6 pMD19-T-PCV2-Flag质粒的构建及鉴定
    3 结果
        3.1 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因的核苷酸序列分析
        3.2 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因的核苷酸及氨基酸同源性分析
        3.3 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因构建的系统进化树分析
        3.4 PCV2 GZ-RH1株ORF2编码的蛋白预测分析
            3.4.1 ORF2编码的Cap蛋白基本特性分析
            3.4.2 ORF2编码的Cap蛋白潜在磷酸化位点
            3.4.3 ORF2编码的蛋白基序和结构域分析
            3.4.4 PCV2编码的Cap蛋白结构预测分析
        3.5 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因密码子偏爱性分析
        3.6 pMD19-T-PCV2质粒的构建
        3.7 pMD19-T-PCV2-Flag质粒的构建
    4 讨论
    5 结论
第三章 携带标记的PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒表达载体的构建
    1 材料
        1.1 毒株、质粒和细胞
        1.2 主要试剂
        1.3 实验主要仪器
    2 方法
        2.1 V5和Flag标记的Cap蛋白的结构预测与引物设计
        2.2 标记PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒表达载体的构建策略
        2.3 重组转移载体的构建及鉴定
            2.3.1 ORF2-V5、ORF2-Flag的T克隆
            2.3.2 pFastBacHTA-ORF2-V5与pFastBacHTA-ORF2-Flag的构建及鉴定
        2.4 杆粒rBacmid-Cap-V5和rBacmid-Cap-Flag的制备
        2.5 Sf-9细胞的培养
        2.6 细胞转染及病毒粒子收集
        2.7 昆虫杆状病毒粒子的观察
        2.8 感染杆状病毒的Sf-9细胞的IFA检测
        2.9 重组标记蛋白表达的Western-blotting检测
    3 结果
        3.1 V5和Flag标记的Cap蛋白的结构预测
        3.2 重组转移载体的构建及鉴定
            3.2.1 ORF2-V5、ORF2-Flag的T克隆
            3.2.2 pFastBacHTA-ORF2-V5与pFastBacHTA-ORF2-Flag的构建及鉴定
        3.3 rBacmid-Cap-V5和rBacmid-Cap-Flag的制备
        3.4 细胞转染及病毒粒子收集
        3.5 重组杆状病毒的透射电子显微镜观察
        3.6 感染杆状病毒的Sf-9细胞的IFA检测
        3.7 Western-blotting试验结果
    4 讨论
    5 结论
参考文献
附录一 攻读硕士学位期间所获成果
致谢



本文编号：3836662