基因Ⅰ型与Ⅲ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子机制

发布时间：2023-10-15 17:38

　　日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)属于黄病毒科黄病毒属,能够引起人的中枢神经系统损伤和猪的繁殖障碍等疾病,在自然界中主要是通过蚊虫叮咬进行传播,蚊子是病毒的传播宿主,水禽和猪是病毒主要的扩增宿主。根据病毒E基因序列可将JEV分为五个基因型,即基因I、II、III、IV、V型(GI、II、III、IV、V)。从上世纪30年代到20世纪末,GⅢ型毒株一直占据着亚洲地区JEV流行的主要地位,但最近二十年GⅠ型JEV逐渐替代GⅢ型成为我国乃至整个亚洲地区的主要流行毒株,而对于基因型转换的分子机制目前尚不清楚。最近研究发现,GⅠ型JEV相对于GⅢ型在水禽宿主中具有适应性的优势,能够引起雏鸭产生滴度更高、持续时间更长的病毒血症,而宿主适应性的差异被认为可能是引起JEV基因型转换的一个重要的原因。为解析GⅠ型与GⅢ型JEV在水禽宿主中适应性差异的分子基础,本研究首先建立了GⅠ型与GⅢ型JEV PCR-Based反向遗传学系统。GⅠ型与GⅢ型JEV基因组全序列的同源性约为88.9%,存在12.3%的差异性,而基因组序列间的差异,限制了酶切位点的选择,为后期G...

【文章页数】：132 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 乙型脑炎概述
        1.1.1 乙型脑炎流行病学特征
        1.1.2 乙型脑炎的临床症状与病理变化
        1.1.3 乙型脑炎的防控措施
    1.2 乙型脑炎病毒
        1.2.1 乙型脑炎病毒的形态、理化及生物特性
        1.2.2 乙型脑炎病毒基因组结构及其功能
        1.2.3 乙型脑炎病毒复制周期
        1.2.4 乙型脑炎病毒基因型分布及基因型转换
    1.3 黄病毒感染性克隆研究进展
    1.4 乙型脑炎病毒反向遗传学系统的应用
    1.5 黄病毒逃逸天然免疫的分子机制
    1.6 本研究的目的与意义
第二章 GⅠ型与GⅢ型 JEV PCR-Based反向遗传学系统的建立
    2.1 材料与方法
        2.1.1 病毒、细胞、质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 病毒的扩增
        2.1.5 病毒RNA的提取
        2.1.6 GⅠ型与GⅢ型 JEV第一链c DNA合成
        2.1.7 GⅠ型与GⅢ型 JEV基因组的分段克隆
        2.1.8 GⅠ型与GⅢ型 JEV全长c DNA的克隆
        2.1.9 病毒的拯救
        2.1.10 拯救病毒的间接免疫荧光鉴定
        2.1.11 拯救病毒的多步生长曲线
        2.1.12 病毒蚀斑试验
    2.2 结果
        2.2.1 GI与 GⅢ型 JEV基因组序列的同源性分析及引物保守型分析
        2.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV基因组分段扩增与克隆
        2.2.3 病毒全长cDNA扩增
        2.2.4 rGI与rGIII JEV的拯救与鉴定
        2.2.5 被拯救病毒与亲本毒生长特性的比较
    2.3 讨论
第三章 GI与 GⅢ型 JEV在水禽宿主中诱导IFN-I表达的差异
    3.1 材料与方法
        3.1.1 病毒、细胞、实验动物
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 鸭胚成纤维细胞的制备
        3.1.5 RNA提取与反转录
        3.1.6 荧光定量PCR检测Ⅰ型干扰素表达
        3.1.7 ELISA方法检测Ⅰ型干扰素的表达量
        3.1.8 细胞上清中病毒滴度测定
        3.1.9 细胞中病毒蛋白水平测定
        3.1.10 雏鸭动物实验
    3.2 结果
        3.2.1 三种细胞感染JEV后间接免疫荧光验证
        3.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导Ⅰ型干扰素表达的差异
        3.2.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV在宿主细胞中病毒滴度的测定
        3.2.5 GⅠ型与GⅢ型 JEV在雏鸭体内诱导干扰素表达的差异
    3.3 讨论
第四章 GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导水禽宿主IFN-I表达差异的分子基础
    4.1 材料与方法
        4.1.1 细胞、质粒、病毒
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV氨基酸序列的比对分析
        4.1.5 嵌合病毒与定点突变病毒的构建
        4.1.6 嵌合病毒与定点突变病毒在DEF中诱导IFN-I表达能力分析
        4.1.7 嵌合病毒与定点突变病毒复制动力学分析
        4.1.8 嵌合病毒与定点突变病毒的空斑形成试验
        4.1.9 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白拮抗IFN-I表达能力分析
        4.1.10 小鼠动物实验
        4.1.11 雏鸭动物实验
    4.2 结果
        4.2.1 GⅠ型与GⅢ型 JEV差异性氨基酸位点分析
        4.2.2 GⅠ型与GⅢ型 JEV间结构蛋白相互替换嵌合病毒的构建及拯救
        4.2.3 结构蛋白相互替换的嵌合病毒诱导Ⅰ型干扰素能力分析
        4.2.4 结构蛋白相互替换的嵌合病毒复制动力学分析
        4.2.5 非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B/NS3、NS4A/NS4B、NS5 相互替换的嵌合病毒构建
        4.2.6 非结构蛋白NS5 决定GⅠ型与GⅢ型 JEV诱导IFN-I表达的差异
        4.2.7 非结构蛋白NS5 决定GⅠ型 JEV在 DEF细胞中的复制优势
        4.2.8 NS5-a-a Rd Rp区域决定GI与 GⅢ型 JEV诱导IFN-I表达的差异
        4.2.9 NS5-a-a Rd Rp区域决定GⅠ型 JEV在 DEF中的复制优势
        4.2.10 NS5-372-386 位点共同决定GⅠ型与GⅢ型 JEV在 DEF中诱导IFN-表达的差异
        4.2.11 NS5-372-386 位点共同决定GⅠ型与GⅢ型 JEV在 DEF中复制差异.
        4.2.12 NS5-V372A-H386Y位点突变不改变病毒对小鼠的毒力
        4.2.13 NS5-372V-386H位点决定GⅠ型 JEV在雏鸭宿主中适应性的优势
    4.3 讨论
第五章 NS5-V372A-H386Y决定水禽宿主IFN-I表达差异的分子机制
    5.1 材料与方法
        5.1.1 细胞、质粒、病毒
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 主要仪器
        5.1.4 细胞核与细胞质蛋白分离
        5.1.5 鸭源核转运受体蛋白与鸭源IRF7分子的克隆表达
        5.1.6 鸭源核转运受体蛋白与JEVNS5蛋白分子的互作
        5.1.7 鸭源核转运受体蛋白与duIRF7分子的互作
        5.1.8 鸭源核转运受体蛋白du KPNA4与du IRF7 共定位实验
        5.1.9 鸭源核转运受体蛋白du KPNA4对Ⅰ型干扰素表达的作用
        5.1.10 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5-372 与386 位点的同性氨基酸替代
        5.1.11 NS5-372-386 位点突变病毒的诱导IFN-I表达能力分析
        5.1.12 NS5-372-386位点突变病毒的复制动力学分析
        5.1.13 NS5-372-386位点突变病毒的空斑形成试验
    5.2 结果
        5.2.1 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白核定位能力分析
        5.2.2 GⅠ型与GⅢ型 NS5 蛋白与du KPNA2、du KPNA3、du KPNA4 互作
        5.2.3 鸭源IRF7 分子与核转运受体蛋白du KPNA4 互作
        5.2.4 GⅠ型与GⅢ型 JEV NS5 蛋白不与du IRF7 分子互作
        5.2.5 du KPNA4 促进du IRF7 分子入核启始IFN-I表达
        5.2.6 NS5-372-386 位点决定NS5 蛋白与du KPNA4 的结合能力
        5.2.7 NS5-372-386 氢键排布决定GⅠ型与GⅢ型 JEV对水禽宿主适应性
    5.3 讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3854357