粪肠球菌CTB β-葡萄糖苷酶基因的克

发布时间：2023-11-04 11:49

　　如何水解自然界中最丰富的碳水化合物——纤维素是一个重要课题,纤维素的水解依赖于内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC3.2.1.74)、纤维二糖水解酶(EC3.2.1.176)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)的协同作用。其中β-葡萄糖苷酶将纤维二糖或寡糖水解为非还原末端的葡萄糖,可有效减轻纤维素酶水解过程中纤维二糖对纤维素酶活性的抑制,提高纤维素降解效果。课题组前期从反刍动物绵羊瘤胃中分离筛选到一株可降解纤维素的粪肠球菌CTB(Enterococcus faecalis CTB),并且检测到该菌株具有β-葡萄糖苷酶活性。为了探究粪肠球菌为何会有β-葡萄糖苷酶活性,该酶有何特点或特殊性,对该菌株进行了基因组完成图测序,结果表明具有多条β-葡萄糖苷酶基因,从中选取两条代表性基因进行PCR扩增,以E.coli BL21(DE3)为宿主对蛋白进行表达,表达的蛋白分别命名为bgl1213和bgl2557。bgl1213显示出β-葡萄糖苷酶活性,bgl2557展现出β-半乳糖苷酶活性。CTB-2557表达的最优条件为:最适温度30℃,最适培养时间12 h,IPTG浓度1.2...

【文章页数】：104 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 引言
    1.2 β-葡萄糖苷酶简介
    1.3 β-葡萄糖苷酶分类
        1.3.1 根据底物特异性对β-葡萄糖苷酶进行分类
        1.3.2 根据核苷酸序列同一性(NSI)对β-葡萄糖苷酶进行分类
    1.4 β-葡萄糖苷酶活性及作用底物
    1.5 产β-葡萄糖苷酶的微生物
        1.5.1 产β-葡萄糖苷酶的细菌
        1.5.2 产β-葡萄糖苷酶的真菌
    1.6 β-葡萄糖苷酶的克隆及异源表达
    1.7 β-葡萄糖苷酶的应用
        1.7.1 β-葡萄糖苷酶在生物乙醇生产中的重要作用
        1.7.2 β-葡萄糖苷酶在食品中的重要作用
        1.7.3 β-葡萄糖苷酶在医药中的作用
    1.8 课题的研究意义及内容
        1.8.1 课题的研究意义
        1.8.2 技术路线图
第二章 Enterococcus faecalis CTBβ-葡萄糖苷酶基因的克隆
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 培养基
        2.1.3 实验仪器和试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌株培养
        2.2.2 Enterococcus faecalis CTB基因组提取
        2.2.3 引物设计
        2.2.4 PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因片段
        2.2.5 克隆载体的构建
        2.2.6 重组质粒的转化
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 Enterococcus faecalis CTBβ-葡萄糖苷酶基因的克隆及回收
        2.3.2 阳性克隆菌株的鉴定
        2.3.3 序列测定及分析
    2.4 小结
第三章 Enterococcus faecalis CTBβ-葡萄糖苷酶基因的表达
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 培养基
        3.1.3 实验试剂和仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 表达载体的构建
        3.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
        3.2.3 酶活测定
        3.2.4 诱导温度对产酶的影响
        3.2.5 诱导时间对产酶的影响
        3.2.6 IPTG浓度对产酶的影响
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 重组子的筛选及鉴定
        3.3.2 重组菌株在大肠杆菌中的诱导表达
    3.4 小结
第四章 重组β-葡萄糖苷酶的纯化及性质研究
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株、培养基
        4.1.2 实验试剂和仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 粗酶液的制备
        4.2.2 纯化重组β-葡萄糖苷酶
        4.2.3 SDS-PAGE凝胶检测
        4.2.4 浓缩重组β-葡萄糖苷酶
        4.2.5 bgl1213 的酶学性质研究
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 bgl1213 的纯化结果
        4.3.2 bgl1213 酶学性质分析
    4.4 小结
第五章 重组β-半乳糖苷酶的纯化及性质研究
    5.1 实验材料
        5.1.1 菌株和培养基
        5.1.2 实验试剂和仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 粗酶液的制备
        5.2.2 纯化重组β-半乳糖苷酶
        5.2.3 SDS-PAGE凝胶检测
        5.2.4 浓缩重组β-半乳糖苷酶
        5.2.5 bgl2557 的酶学性质研究
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 bgl2557 的纯化结果
        5.3.2 bgl2557 的酶学性质研究结果
    5.4 小结
总结与展望
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3860248