牛口蹄疫鉴别抗体胶体金免疫层析方法的建立

发布时间：2023-11-11 12:07

　　口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是一种具有高度传染性的疾病,它发病急,传播快,易感动物种类多,主要侵害猪、牛、羊等经济价值大的牲畜和野生偶蹄兽,该病在世界流行广泛,造成的影响也极为严重。口蹄疫以疫苗免疫防控为主,但临床存在的自然感染和疫苗免疫现象,对该病的诊断带来了极大的困难。世界动物卫生组织(OIE)和世界口蹄疫参考实验室推荐使用的诊断方法在临床中条件受限,不易操作,而胶体金免疫层析技术日益发展成熟,在兽医临床检测应用广泛,它具有操作简便、用时短、结果直观可靠、较高的灵敏性和特异性等优点,更适用于口蹄疫的临床检测。本试验利用DNAstar基因分析软件分析、筛选、预测出口蹄疫病毒的非结构蛋白3ABC中抗原性强,疏水性好、表面可及性优良、柔韧性强的2段氨基酸,将其对应的基因序列片段3ABCa和3ABCb,这2段基因之间用GSLinker序列连接,参考克隆载体的酶切位点并选定EcoRI和XhoI为酶切位点,将融合好的基因序列送与合成得到重组克隆载体pET28a-3ABCab。重组克隆载体存在于大肠杆菌DH-5α中,通过恒温振荡培养的方式对目的基因进行扩增,通过...

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词表
1 引言
    1.1 口蹄疫概述
    1.2 FMDV基本结构
    1.3 口蹄疫诊断技术研究进展
        1.3.1 病原学诊断
        1.3.2 血清学诊断
        1.3.3 间接夹心ELISA
        1.3.4 抗体检测
        1.3.5 RT-PCR技术
        1.3.6 新诊断技术研究进展
        1.3.7 区分自然感染动物和免疫动物及理论依据
    1.4 免疫胶体金技术及应用
        1.4.1 免疫胶体金技术基本原理
        1.4.2 免疫胶体金快速诊断技术
    1.5 研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 临床样品血清及载体
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 主要试剂及材料
        2.1.4 溶液及培养基的配制
    2.2 试验方法
        2.2.1 FMDV融合基因的合成及pET-28a(+)通用引物的合成
        2.2.2 原核表达载体的构建
        2.2.3 重组表达载体的表达及蛋白的纯化
        2.2.4 纯化蛋白的Westernblot鉴定
        2.2.5 胶体金免疫层析方法的建立
3 结果
    3.1 FMDV3ABCab蛋白DNAstar分析及抗原蛋白和基因筛选结果
    3.2 原核表达载体的构建
        3.2.1 pET28a-3ABCab质粒的酶切鉴定
        3.2.2 pET-28a(+)空载双酶切鉴定
        3.2.3 pET28a-3ABCab特异性引物PCR扩增鉴定
        3.2.4 pET28a-3ABCab基因菌液PCR鉴定
        3.2.5 pET28a-3ABCab质粒的酶切鉴定
    3.3 融合蛋白的表达及纯化
        3.3.1 pET28a-3ABCab阳性菌在不同时间点的表达产物及蛋白可溶性的SDS-PAGE鉴定
        3.3.2 纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定结果
        3.3.3 纯化蛋白的浓度测定结果
        3.3.4 纯化蛋白的Westernblot鉴定
    3.4 胶体金免疫层析方法的建立
        3.4.1 胶体金最适pH值的确定
        3.4.2 胶体金最适SPA标记量的确定
        3.4.3 最佳喷金量的确定
        3.4.4 T线划线蛋白3ABCab浓度的筛选确定
        3.4.5 检测卡有效性的检验
        3.4.6 检测卡交叉性的检验
        3.4.7 田间试验
4 讨论
5 结论
参考文献
附录A
附录B
附录C
作者简历
致谢
详细摘要



本文编号：3862565