禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白在水稻胚乳中的稳定、高效表达及活性鉴定

发布时间：2023-11-11 13:02

　　为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白。首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植。利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T₀阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T₁叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T₃植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性。结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-...

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 试验材料
    1.2 试验方法
        1.2.1 HA基因序列优化及引物设计
        1.2.2 中间载体和植物表达载体的构建
        1.2.3 HA基因的水稻遗传转化
        1.2.4 转基因水稻植株的PCR检测
        1.2.5 T1水稻种子HA蛋白的表达鉴定
        1.2.6 纯合子植株的筛选
        1.2.7 高表达杂交植株的筛选
        1.2.8 HA蛋白活性检测
2 结果与分析
    2.1 重组质粒的鉴定与分析
    2.2 HA阳性植株的筛选与分析
    2.3 HA蛋白表达鉴定与分析
    2.4 T1HA纯合子植株的筛选与分析
    2.5 高表达杂交植株的鉴定与分析
    2.6 HA蛋白ELISA检测分析
3 结论与讨论



本文编号：3862595