基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除水牛BMP15和GDF9基因的研究

发布时间：2023-12-28 18:22

　　水牛因具有易饲养、乳质好、抗逆性强等诸多优良的生物学特性,被认为最具开发价值的经济物种之一。但我国本地水牛因发情不明显、乏情期长、产后卵巢长时间不活动等因素影响,导致繁殖性能普遍较低,致使我国水牛产业发展严重滞后。因此如何提高水牛的繁殖能力,成为推动水牛业的发展亟需解决的关键问题。研究表明BMP15和GDF9基因在雌性动物的卵泡发育过程中发挥重要作用,杂合突变的BMP15和GDF9绵羊产羔率显著高于野生型,临床医学数据也表明女性BMP15和GDF9发生突变也显著影响受孕率。为此,本研究应用CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术突变BMP15和GDF9基因,探讨提高水牛繁殖性能的可行性。主要研究结果如下：1.水牛BMP15和GDF9基因的克隆及其在卵泡发育过程中的表达。通过PCR、 RT-PCR成功克隆得到水牛BMP15基因的全长CDS及全基因组序列,长度分别为1185 bp和6490 bp,序列比对显示与奶牛相应序列的相似性分别为99%和97%。水牛GDF9的全长CDS为1362bp,与奶牛序列相似性为98%。对水牛BMP15和GDF9蛋白结构通过生物信息学的预测,分析显示在氨基酸29...

【文章页数】：97 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    引言
    1.1 TGF-b超家族对卵泡发育的影响
        1.1.1 配体
        1.1.2 受体
        1.1.3 TGF-b超家族的信号传递
        1.1.4 TGF-b超家族的活性调节
        1.1.5 BMP15和GDF9对卵泡发育的影响
    1.2 基因编辑
        1.2.1 人工核酸酶对基因组的编辑
        1.2.2 CRISPR/Cas9发展史
        1.2.3 CRISPR/Cas9的功能
        1.2.4 CRISPR/Cas9基因编辑的原理
    1.3 DNA断裂修复途径的选择
        1.3.1 DSB的产生
        1.3.2 DSB的修复途径
        1.3.3 染色体介导的调控DSB修复途径选择
        1.3.4 53BP1促进NEHJ
        1.3.5 BRCA1抑制53BP1依赖性的NHEJ,促进HR
        1.3.6 细胞周期调控DSB末端的切割和修复途径的选择
        1.3.7 染色体结构调控DSB修复途径
        1.3.8 组蛋白抑制剂对DNA修复关键蛋白的影响
    1.4 展望
第二章 水牛BMP15和GDF9克隆及卵泡发生相关基因在卵巢发育各时期的表达规律研究
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验材料
    2.2 实验方法
        2.2.1 引物设计
        2.2.2 基因组和总RNA提取
        2.2.3 PCR、RT-PCR和qPCR
        2.2.4 感受态制备及转化
        2.2.5 PCR产物回收、克隆及测序
        2.2.6 蛋白结构的预测
    2.3 实验结果
        2.3.1 PCR扩增、克隆与测序
        2.3.2 QPCR检测卵泡不同发育时期相关基因的表达规律
        2.3.3 水牛BMP15启动子的构建和启动活性的分析
        2.3.4 水牛BMP15和GDF9发生相关基因生物信息学分析
    2.4 结果分析及讨论
    2.5 结论
第三章 CRISPR/Cas9系统敲除效率的研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 gRNA设计
        3.2.2 gRNA表达载体及活性验证载体的构建和检测
        3.2.3 感受态制备及转化
        3.2.4 gRNA活性分析
        3.2.5 统计分析gRNA各位位点碱基分布的概率
    3.3 实验结果
        3.3.1 gRNA活性分析
        3.3.2 不同gRNA和Cas9摩尔及培养时间对Cas9编辑效率的影响
        3.3.3 活性gRNA各位点不同碱基分布概率统计
    3.4 结果分析及讨论
    3.5 结论
第四章 CRISPR/Cas9系统编辑人源miRNA的研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
    4.2 实验方法
        4.2.1 gRNA设计
        4.2.2     gRNA表达载体及活性验证载体的构建和检测
        4.2.3 gRNA活性分析
        4.2.4 CRISPR/Cas9靶向编辑miRNA-182和miRNA-155的检测
        4.2.5 miRNA-182和miRNA-155的靶向编辑效率的统计
    4.3 实验结果
        4.3.1 gRNA活性分析
        4.3.2 CRISPR/Cas9靶向编辑miRNA-182和miRNA-155
        4.3.3 miRNA-182和miRNA-155突变类型及效率的统计
    4.4 结果分析及讨论
    4.5 结论
第五章 应用CRISPR/Cas9系统编辑水牛体细胞基因组的研究
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验材料
    5.2 实验方法
        5.2.1 引物设计
        5.2.2 gRNA表达载体及活性验证载体的构建和检测
        5.2.3 感受态制备及转化
        5.2.4 gRNA活性分析
        5.2.5 BFF细胞的分离和培养
        5.2.6 BFF细胞冻存与复苏
        5.2.7 BFF细胞的转染
        5.2.8 CRISPR/Cas9靶向编辑水牛BMP15和GDF9的检测
        5.2.9 CRISPR/Cas9靶向编辑水牛BMP15基因脱靶效率的检测
        5.2.10 CRISPR/Cas9靶向编辑水牛BMP15基因大片段删除的检测
        5.2.11 CRISPR/Cas9靶向同时编辑BMP15和GDF9基因的检测
    5.3 实验结果
        5.3.1 水牛BMP15和GDF9的gRNA活性分析
        5.3.2 水牛gRNA4-bBMP15和gRNA5-GDF9靶向敲除的检测
        5.3.3 水牛gRNA5-bBMP15和gRNA4-GDF9靶向敲除的检测
        5.3.4 水牛BMP15基因大片段的删除
        5.3.5 CRISPR/Cas9在水牛BFF细胞脱靶效率的分析
    5.4 结果分析及讨论
    5.5 结论
第六章 基因断裂DNA修复机制的选择的探究
    6.1 材料与方法
        6.1.1 实验材料
    6.2 试验方法
        6.2.1 gRNA设计
        6.2.2 293T细胞对不同药物的毒性分析
        6.2.3 细胞转染Reportor及相应gRNA表达载体
        6.2.4 转染后细胞总RNA及蛋白的提取
        6.2.5 细胞周期的分析
    6.3 实验结果
        6.3.1 293T细胞对不同药物的毒性分析
        6.3.2 Reportor荧光表达流式分析
        6.3.3 不同药物联合处理处理对DNA修复机制的选择分析
        6.3.4 TSA处理后对细胞周期的影响
    6.4 结果分析及讨论
    6.5 结论
参考文献
致谢
攻读硕博期间发表学术论文



本文编号：3875944