苜蓿皂苷的制备及其生物活性的研究

发布时间：2017-05-24 05:05

  本文关键词：苜蓿皂苷的制备及其生物活性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：苜蓿皂苷是苜蓿体内生物活性较强的次生代谢产物,饲料中添加苜蓿皂苷可以降低鸡蛋胆固醇、降低仔猪腹泻率、提高动物机体抗氧化能力。本课题通过制备苜蓿皂苷,研究苜蓿皂苷对鸡胚血管生成的作用和对鸡胚脂肪代谢的影响。采用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)技术相结合,建立苜蓿皂苷的分离检测方法,进一步用液-质联用技术对皂苷单体分子进行鉴定,采用体外法对苜蓿皂苷的抗氧化活性进行研究;以鸡胚绒毛尿囊膜为模型,研究苜蓿皂苷对鸡胚血管生长的影响;探讨苜蓿皂苷对鸡胚发育过程中脂肪代谢的影响。1.以甲醇为萃取剂,超声波辅助萃取苜蓿皂苷;以氯仿-甲醇-水(65:35:10,下层)做展开剂,经TLC(薄层板规格5 cm×20 cm)分离后于254 nm处观察并收集不同比移值的分离组分,获得5种皂苷化合物,比移值分别为I(0.08)、II(0.18)、III(0.49)、IV(0.63)、V(0.80);将5种皂苷化合物经高效液相色谱(HPLC)进一步分离,色谱柱为Venusil Mp C18(2)(4.6 mm×250 mm),在室温下以甲醇-水(15:85)为流动相,流速为0.15 mL/min、0.2 mL/min,以及甲醇-水(20:80)做流动相,流速为0.3 mL/min,检测波长为200 nm,共获得13种苜蓿皂苷单体。采用液-质联用技术对获得的皂苷单体进行鉴定,得到质荷比(m/z)为475的离子碎片峰,经比对该离子碎片可能为大豆皂醇A(分子量474)或类似物。苜蓿皂苷在体外有较强的抗氧化能力,当苜蓿皂苷浓度从0.09mg/mL提升至0.72 mg/mL时,羟基自由基(?OH)的清除率从17.46%提升至70.29%,超氧自由基(O2-?)的清除率从9.23%提升至46.38%,DPPH自由基的清除率从26.86%提升至76.12%。2.以鸡胚绒毛尿囊膜为模型,研究苜蓿皂苷在0.00~0.36 mg/mL浓度范围内对血管生成的影响。选择新鲜、健康种蛋150枚,自然生长组10枚不做任何处理,做阳性对照,试验组分别在绒毛尿囊膜上放置0.00 mg/mL(0剂量)、0.09 mg/mL(低剂量)、0.18 mg/mL(中剂量)、0.36 mg/mL(高剂量)的3 mm自制苜蓿皂苷药片。结果表明:中剂量组的一、二级血管数量与0剂量组相比平均分别增加了34条和42条,高剂量试验组分别增加了63条、69条血管,均达到了显著水平(P0.05)。与对照组相比,中、高剂量组的小血管数量极显著的增加,分别平均增加了26条、46条血管(P0.01);而低、中、高剂量的三个试验组中大血管的数量与0剂量组相比血管增加数量不明显(P0.05),平均分别增加了3条、3条和2条血管。说明在0.00~0.36 mg/mL范围内,苜蓿皂苷可以显著增加鸡胚绒毛尿囊膜苜蓿皂苷药片周围小血管的密度与数量,对血管的新生有促进作用,且其促血管生长作用与苜蓿皂苷的浓度呈正相关性。3.以微孔注射方式,在鸡胚发育的3个关键时间点注射苜蓿皂苷,研究不同注射时间对鸡胚发育的影响。选择新鲜、健康种蛋220枚,采用单因素实验设计,对照组正常孵化,试验组分别在入孵前、第7胚龄、第18胚龄时注射0.32 mg/mL的苜蓿皂苷溶液100?L。试验结果表明:(1)不同时间注射苜蓿皂苷对雏鸡的出生体重没有影响(P0.05),但可以提高雏鸡的出壳率。18胚龄注射组的出壳率最高,与入孵前注射组和7胚龄注射组相比提高了12.5%和10.7%。(2)7胚龄注射苜蓿皂苷对血清中血脂的降低效果最好,第7胚龄注射组的总胆固醇、甘油三酯含量与对照组相比分别降低了74.45%、46.61%,均达到了极显著水平(P0.01);低密度脂蛋白胆固醇显著下降了48.5%(P0.05)。18胚龄注射苜蓿皂苷血清中抗氧化力最高,与对照组相比,18胚龄注射组血清总抗氧化能力极显著提高了42.25%(P0.01),总超氧化物歧化酶提高了35.56%(P0.05)。而各处理组高密度脂蛋白胆固醇含量降低不明显(P0.05)。(3)与对照组相比,7胚龄注射组肌肉中总饱和脂肪酸含量为66.41%,降低了4.37%;而总不饱和脂肪酸占26.47%,增加了3.55%。7胚龄注射组腹脂中总饱和脂肪酸含量为36.33%,较空白对照组降低了1.24%;总不饱和脂肪酸含量为63.36%,较空白对照组增加了2.64%。苜蓿皂苷改善了腿肌和腹脂中的饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例,第7胚龄注射组改善效果最优。
【关键词】：苜蓿皂苷 鸡胚 血管生成 脂肪代谢
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S816
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 1 绪论13-22
• 1.1 课题研究目的与意义13
• 1.2 苜蓿皂苷的组成与分布13-15
• 1.2.1 苜蓿皂苷的组成13-14
• 1.2.2 苜蓿皂苷的含量分布14-15
• 1.3 苜蓿皂苷的制备与含量测定15-17
• 1.3.1 苜蓿皂苷的分离提取15
• 1.3.2 苜蓿皂苷的纯化15
• 1.3.3 苜蓿皂苷含量测定15-17
• 1.4 苜蓿皂苷单体的分子结构研究进展17-18
• 1.5 苜蓿皂苷在动物生产上的应用18-20
• 1.5.1 在反刍动物生产上的应用18-19
• 1.5.2 在单胃动物生产上的应用19-20
• 1.6 研究内容和研究方法20-22
• 1.6.1 研究内容20
• 1.6.2 研究方法20-21
• 1.6.3 技术路线21-22
• 2 试验研究22-52
• 试验一 苜蓿皂苷的制备、结构分析及抗氧化活性研究22-33
• 1.1 前言22
• 1.2 材料与方法22-24
• 1.2.1 样品与试剂22-23
• 1.2.2 主要仪器设备23
• 1.2.3 实验方法23-24
• 1.3 结果与分析24-30
• 1.3.1 苜蓿皂苷的薄层层析（TLC）24-27
• 1.3.2 苜蓿皂苷的HPLC分离27-28
• 1.3.3 苜蓿皂苷液相－质谱分离图谱28-29
• 1.3.4 苜蓿皂苷抗氧化研究29-30
• 1.4 讨论30-32
• 1.4.1 薄层层析展开剂的选择30-31
• 1.4.2 高效液相分离苜蓿皂苷条件优化31
• 1.4.3 液－质联用技术对苜蓿皂苷单体的确证31-32
• 1.4.4 苜蓿皂苷抗氧化能力分析32
• 1.5 小结32-33
• 试验二 苜蓿皂苷对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响研究33-41
• 2.1 前言33
• 2.2 试验材料33-34
• 2.3 试验方法34-35
• 2.3.1 苜蓿皂苷药片的制备34
• 2.3.2 实验设计34
• 2.3.3 鸡胚绒毛尿囊膜模型制备34-35
• 2.3.4 统计分析35
• 2.4 结果与分析35-39
• 2.4.1 种蛋孵化过程中的血管发育35-36
• 2.4.2 苜蓿皂苷对鸡胚血管发育的影响36-38
• 2.4.3 苜蓿皂苷对鸡胚生长发育的影响38-39
• 2.5 讨论39-40
• 2.5.1 鸡胚尿囊膜模型的建立39
• 2.5.2 苜蓿皂苷对血管和鸡胚生长状态的影响39-40
• 2.6 小结40-41
• 试验三 苜蓿皂苷对鸡胚发育期间脂肪代谢的影响研究41-52
• 3.1 前言41
• 3.2 试验材料41-42
• 3.3 试验方法42-43
• 3.3.1 皂苷注射液的配制42
• 3.3.2 实验设计42
• 3.3.3 种蛋的注射42-43
• 3.3.4 样品采集与指标检测43
• 3.3.5 统计分析43
• 3.4 结果与分析43-48
• 3.4.1 苜蓿皂苷对雏鸡初生重及卵黄率的影响44
• 3.4.2 苜蓿皂苷对鸡雏血脂和抗氧化能力的影响44-45
• 3.4.3 苜蓿皂苷对鸡雏肌肉中脂肪酸含量的影响45-46
• 3.4.4 苜蓿皂苷对鸡雏腹脂中脂肪酸含量的影响46-48
• 3.5 讨论48-50
• 3.5.1 苜蓿皂苷对鸡胚出生率的影响48-49
• 3.5.2 苜蓿皂苷对鸡胚出雏重和卵黄率的影响49
• 3.5.3 苜蓿皂苷对鸡胚血脂含量和血清抗氧化能力的影响49-50
• 3.5.4 苜蓿皂苷对鸡肉脂肪代谢的影响50
• 3.6 小结50-52
• 3 结论52-54
• 3.1 主要结论52-53
• 3.2 有待进一步研究的问题53-54
• 参考文献54-60
• 致谢60-61
• 个人简历61

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本文编号：389850