应用SELEX技术体外筛选PRRSV核衣壳蛋白的DNA适配子

发布时间：2024-03-23 08:26

　　猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪繁殖与呼吸综合征,俗称“蓝耳病”。该病1987年最早报道于美国,1991在荷兰分离到病毒,我国大陆哈尔滨兽医研究所于1996年首次报道并分离到病原,目前该病流行于世界各养猪国家,给世界养猪也带来巨大的经济损失。PRRSV不分节段单股正链的RNA病毒,为尼多目动脉炎病毒属,成熟病毒粒子直径约50-60nm,有囊膜。基因组全长约15kb,共有9个开放阅读框(ORFs)。ORF7编码约15kDa的核衣壳(N)蛋白。N蛋白在病毒表达的蛋白中含量高,有4-5个抗原决定簇,免疫原性极强,因此非常适合用于疾病诊断。 指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SLEXE)技术是上世纪九十年代产生的一种新型组合化学技术。应用SELEX技术可以从一个大容量随机寡聚核苷酸文库中筛选针对靶物质的亲和性和特异性的适配子。本实验首次运用SELEX技术筛选特异性针对PRRSV N蛋白的ssDNA适配子。通过测定适配子与N蛋白的亲和性和专一性,评估适配子应用于PRRSV的早期诊...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略语表（ABBREVIATION)
第一章 文献综述
    1.1 PRRSV目前研究进展
    1.2 SELEX技术和适配子
        1.2.1 SELEX基本原理
        1.2.2 初始随机核苷酸文库
        1.2.3 靶物质
        1.2.4 筛选过程
        1.2.5 次级文库生成
        1.2.6 克隆和序列分析
        1.2.7 特异性和亲和性分析
        1.2.8 适配子修饰
        1.2.9 SELEX技术和适配子的优缺点
        1.2.10 适配子应用及前景
第二章 研究目的和意义
第三章 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 载体与质粒
        3.1.2 工具酶与主要试剂
        3.1.3 主要缓冲液与相关试剂及其配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 PRRSV核衣壳蛋白的表达与纯化
        3.2.2 初始随机文库的构建及引物合成
        3.2.3 初始文库通过PCR扩增成双链库
        3.2.4 琼脂糖凝胶电泳
        3.2.5 双链文库的回收
        3.2.6 不对称PCR扩增ssDNA文库或生物素标记的ssDNA文库
        3.2.7 单链适配子文库的回收
        3.2.8 N蛋白的ssDNA适配子筛选过程
        3.2.9 ssDNA亚库亲和性测定
        3.2.10 筛选产物的克隆及鉴定
        3.2.11 测序及序列分析
        3.2.12 适配子亲和性和特异性
        3.2.13 适配子与PRRSV N蛋白的剂量依赖关系的确定
        3.2.14 适配子与PRRSV之间相互作用的鉴定
第四章 结果与分析
    4.1 PRRSV核衣壳蛋白的表达纯化
    4.2 适配子初始文库的构建及鉴定
    4.3 双链文库的生成及回收
    4.4 单链文库的生成及回收
    4.5 适配子亚库亲和力测定
    4.6 筛选产物的克隆
    4.7 测序
    4.8 序列分析
        4.8.1 序列比对及碱基组成分析
        4.8.2 二级结构分析
    4.9 适配子与N蛋白亲和性分析
    4.10 抗原依赖性
    4.11 特异性分析
    4.12 适配子与PRRSV亲和性鉴定
第五章 讨论与结论
    5.1 讨论
        5.1.1 PRRSV N蛋白的纯化
        5.1.2 初始随机寡聚核苷酸文库构建及引物设计
        5.1.3 次级文库的生成
        5.1.4 筛选过程
        5.1.5 适配子序列分析
        5.1.6 适配子亲和性和特异性分析
        5.1.7 适配子检测病毒分析
    5.2 结论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3935645