传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的体外表达及免疫保护效果评价

发布时间：2024-04-13 08:24

　　目的:使用巴斯德毕赤酵母真核表达系统对鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白进行体外表达,通过动物免疫保护试验对其免疫原性和免疫保护效果进行评价。方法:从NCBI基因数据库获取鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的基因序列,在序列两端分别添加Xho Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点和6×His标签基因序列,根据X33毕赤酵母密码子的偏好性对VP2蛋白的基因序列进行优化。运用基因重组技术构建含VP2蛋白基因的重组表达载体pwPICZa-VP2,将其导入X33毕赤酵母构建重组毕赤酵母。大量表达VP2蛋白并进行考马斯亮蓝染色和Western blot验证。进行动物免疫保护试验:VP2蛋白分为10μg、40μg、160μg、10μg+佐剂、40μg+佐剂和160μg+佐剂组给鸡免疫,B87疫苗作为阳性对照、PBS作为阴性对照。通过外周血淋巴细胞增殖和病毒抗体检测探究VP2蛋白在细胞免疫和体液免疫方面的作用。用BC6/85毒株感染鸡,对VP2蛋白的免疫保护效果进行评价。结果:考马斯亮蓝染色、Western blot和去糖基化分析表明,体外成功表达了 VP2蛋白。外周血淋巴细胞增殖结果表明,VP2蛋白对细胞免疫没有影响。...

【文章页数】：47 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１?１ＢＤＶ基因组模式图［１３］??Ｆｉｇ．?１?Ｇｅｎｏｍｉｃ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｆｉｇｕｒｅ?ｏｆ?ＩＢＤＶ??

病毒基因组由大片段Ａ和小片段Ｂ两段双链ＲＮＡ?（ｄｓＲＮＡ）??组成，结构如图１。小片段Ｂ?（２．８ｋｂｐ）包含一个单一的开放阅读框（ＯＲＦ）编码ＶＰ１??蛋白，ＶＰ１是一种具有ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶活性的蛋白质刚。大片段Ａ?（３．２ｋｂｐ）??包含两个重叠的开放阅读框。一个小....

图１ＶＰ２基因双酶切鉴定；Ｍ：?ＤＮＡ分子量标准（ｂｐ）??Ｆ．ｉｆｉｃｉｎ２ｅｎｌｅｎｚｍｔｉＭｒ

３．１目的基因酶切鉴定??将公司合成的含ＶＰ２基因的大肠杆菌培养后，提取含ＶＰ２基因载体用瓜〇?Ｉ和ＥｃｏＲ??Ｉ进行双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳如图１，载体大小为１８６５?ｂｐ，切下的片段大小与１３８６??ｂｐ的ＶＰ２基因一致。??Ｈ??７ＳＱ?ｇｌＢＭｉｌｉｌ—ＳＩ??图１ＶＰ....

图２重组表达载体双酶切鉴定；Ｍ：?ＤＮＡ分子量标准（ｂｐ）??Ｆｉｇ．２?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｂｙ?ｄｏｕｂｌｅ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；?Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?（ｂｐ）??

３．２重组表达载体构建??将ＶＰ２基因胶回收与ｐｗＰＩＣＺａ表达载体连接，转入大肠杆菌感受态提质粒，用油〇??１和￡〇＞１１１进行双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳如图２，表达载体３６００?ｂｐ，切下片段大小??与１３８６?ｂｐ的ＶＰ２基因一致，说明ＶＰ２基因己经成功连接表达载体。??－....

图３重组毕赤酵母ＰＣＲ鉴定；Ｍ：?ＤＮＡ分子量标准（ｂｐ）??Ｆｉ．３?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?Ｐｉｃｈｉａａｓｔｏｒｉｓ?ｂＰＣＲ；?Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒｂ

３．３重组毕赤酵母的ＰＣＲ鉴定??对电转化后的重组毕赤酵母在选择性固体培养基上挑选出的单菌落进行菌落ＰＣＲ，??１％琼脂糖凝胶电泳如图３，在１０００?ｂｐ与２０００?ｂｐ之间扩增出很亮的条带，与１３８６?ｂｐ??的ＶＰ２蛋白基因大小符合，说明挑选的重组毕赤酵母单菌落含有ＶＰ２蛋白....

本文编号：3952752