微小隐孢子虫cDNA文库的构建、筛选与间接ELISA检测方法的建立

发布时间：2024-04-15 21:34

　　微小隐孢子虫(C. parvum)为细胞内原虫，主要感染宿主小肠上皮细胞，可引起人兽共患隐孢子虫病（cryptosporidiosis），该病通常由于宿主接触粪便中的卵囊而传播。在免疫功能正常的宿主体内此病表现为腹痛、发热、呕吐和腹泻等临床症状，一般7-14天可自愈。但是在免疫功能低下的宿主体内，尤其是在艾滋病患者和营养不良的儿童中，此病可能引起持续性腹泻，甚至会导致死亡。由于治疗隐孢子虫病的方法有限，因此对该疾病的早期诊断尤为重要。目前，用于隐孢子虫感染的诊断方法主要是粪检，但该方法存在费时、费力和敏感性低等缺点。免疫学方法具有省时、省力及易于标准化等优点，适用于大规模的流行病学筛查，但该方法的关键在于获得高特异性和敏感性的抗原。 本研究首先采用SMART技术构建微小隐孢子虫cDNA文库。纯化微小隐孢子虫卵囊，Trizol试剂提取总RNA，蛋白酶K消化与Sfi酶切合成的双连cDNA，连接λTriplEx2载体，然后对原始文库进行扩增。测定原始与扩增后的文库滴度分别为4.5×107pfu/mL和8.34×109pfu/mL，文库cDNA插入片段长度为1.5kb左右。用大肠埃希菌裂解液孵...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1.1微小隐孢子虫总RNA的电泳图谱

OD260/OD280值为1.92。1%琼脂糖凝胶电泳检测结果中可以清楚地看到18S和28SrRNA两条较亮的电泳带(图1.1)，提取的总RNA完整并且稳定，可以用于构建cDNA文库。图1.1微小隐孢子虫总RNA的电泳图谱Figure1.1Cryp....

图1.2微小隐孢子虫cDNA的电泳图谱

小隐孢子虫cDNA的oridiumparvumcDNA0Marker;1:Double-str库质量鉴定4，105时，统计噬菌斑始库容量为4.5×107pf长度。从电泳图谱可以1.5kb左右，符合生物06，107，统计每个平板数量为0个，计算得扩

图1.3噬菌斑插入片段长度的PCR检测结果

图1.2微小隐孢子虫cDNA的电泳图谱Figure1.2CryptosporidiumparvumcDNAelectrophoresispatternM:DL2000Marker;1:Double-strandedcDNA小隐孢子虫cDNA文库....

图2.1兔抗微小隐孢子虫血清效价的ELISA检测Figure2.1Detectionofrabbitanti-C.parvumserumtiterbyELISA

阴性血清与每次免疫前的抗血清稀释倍数分别为500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍。结果显示第四次免疫后所得的抗血清效价达到1：16000以上（图2.1），可以作为高免血清抗体用于文库筛选。图2.1兔抗微小隐孢子虫血清效价的ELISA检测Fi....

本文编号：3955981