有机肥中抗生素及其抗性基因的检测和恩诺沙星对生菜内生细菌的喹诺酮抗性基因的影响

发布时间：2024-04-16 00:59

　　在集约化畜禽养殖业中,抗生素不仅用于治疗和预防动物疾病,还被用作动物生长促进剂添加在饲料中,导致养殖场的畜禽粪便中含有大量抗生素残留。养殖业产生的粪肥经处理后,常被用作绿色有机肥用于改良土壤、提高作物产量和品质。由于我国现行的有机肥标准并未将抗生素残留指标列入,有机肥中抗生素的残留状况仍不清楚。有机肥中所含的抗生素及抗生素抗性基因向土壤环境中释放和迁移,导致产生新的环境问题。另外,近几年来一些文献报道植物内生细菌含有多重抗生素抗性,其抗生素抗性基因的来源和产生机制仍不清楚。本文对南京市销售的商品有机肥中的抗生素残留和抗生素抗性基因进行了检测；在土壤中添加抗生素,检测土壤中和在其上盆栽的生菜中抗生素及抗生素抗性基因的变化并分析两者之间的相关性。本研究对研究抗生素及其抗性基因在环境中,特别是食物链中的迁移变化规律有重要价值。对南京市8种商品有机肥中的18种兽药抗生素和相关抗生素抗性基因进行检测。除磺胺类抗生素、金霉素和泰乐菌素,其他抗生素均有不同程度的检出。其中恩诺沙星、四环素和罗红霉素在所测8种有机肥中均有检出,恩诺沙星的检出浓度为24.3～225.5μg·kg-1,四环素为13.9～9...

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
ABSTRACT
缩写
第一章 前言
    一、环境中的抗生素
    二、新型环境污染物—抗生素抗性基因
        (一) ARGs储存库的形成
        (二) ARGs的传播扩散途径
    三、喹诺酮类抗生素概述
        (一) 喹诺酮类抗生素的分类
        (二) 喹诺酮类抗生素的作用机制
        (三) 喹诺酮类抗生素的使用
    四、质粒介导的喹诺酮抗性基因
        (一) PMQR基因的分类及其耐药机制
        (二) PMQR基因的流行
    五、有机肥源抗生素污染的研究
    六、抗生素和ARGs向植物传播的研究
    七、本论文的研究思路
第二章 有机肥中典型抗生素残留测定及相关ARGs检测
    1 实验材料
        1.1 供试材料
        1.2 药品试剂
        1.3 仪器设备
        1.4 溶液及培养基配制
        1.5 酶及引物
        1.6 其他材料
        1.7 菌株培养与保藏
    2 实验方法
        2.1 有机肥中四类典型抗生素残留的同时测定
            2.1.1 样品前处理
            2.1.2 UPLC-MS/MS检测
        2.2 有机肥DNA的提取及抗性基因检测
            2.2.1 有机肥DNA的提取
            2.2.2 ARGs检测
    3 结果与分析
        3.1 有机肥中抗生素的检测
            3.1.1 线性方程和检出限
            3.1.2 南京市售有机肥中4类抗生素检测
        3.2 有机肥DNA提取及ARGs测定
            3.2.1 有机肥DNA提取方法的优化
            3.2.2 ARGs的检测
    4 讨论
第三章 土壤中添加思诺沙星对生菜内生细菌抗性基因qnrA、qnrB的影响
    第一节 PMQR基因阳性克隆构建与qPCR方法的建立
        1 实验材料
            1.1 菌种和质粒
            1.2 药品试剂
            1.3 仪器设备
            1.4 溶液和培养基配制
            1.5 酶及引物
            1.6 其他材料
            1.7 菌株培养与保藏
        2 实验方法
            2.1 阳性克隆的构建
                2.1.1 目的DNA的扩增
                2.1.2 PCR产物纯化回收
                2.1.3 PCR产物装TA克隆
                2.1.4 感受态细胞制备及转化
                2.1.5 阳性克隆的筛选及双酶切验证
                2.1.6 PCR扩增与测序验证
            2.2 荧光实时定量PCR反应
                2.2.1 qPCR方法
                2.2.2 qPCR标准曲线
        3 结果与分析
            3.1 阳性克隆的筛选
            3.2 qPCR方法
    第二节 生菜盆栽试验及相关数据测定
        1 实验材料
            1.1 供试材料
            1.2 药品试剂
            1.3 仪器设备
            1.4 溶液及培养基配制
            1.5 酶及引物
            1.6 其他材料
            1.7 菌株培养与保藏
        2 实验方法
            2.1 实验设计
            2.2 化学分析方法
                2.2.1 土壤中恩诺沙星及环丙沙星的提取
                2.2.2 生菜中恩诺沙星及环丙沙星的提取
                2.2.3 UPLC-MS/MS检测
            2.3 抗性基因的定量
                2.3.1 土壤DNA的提取
                2.3.2 生菜叶片内生细菌的富集及DNA的提取
                2.3.3 qPCR定量
            2.4 内生细菌的分离和鉴定
                2.4.1 内生细菌分离
                2.4.2 内生细菌菌种鉴定
                2.4.3 抗生素敏感性实验
            2.5 数据统计和分析
        3 结果与分析
            3.1 土壤和生菜中的恩诺沙星及环丙沙星
                3.1.1 检测限与定量限
                3.1.2 检测结果
            3.2 土壤和生菜叶片内生细菌的PMQR基因的定量检测
                3.2.1 qPCR引物
                3.2.2 qPCR检测限
                3.2.3 检测结果
            3.3 生菜内生细菌菌种鉴定和耐药性
                3.3.1 内生细菌计数
                3.3.2 菌种鉴定
                3.3.3 药敏试验
                3.3.4 耐药性细菌的PMQR基因扩增
        4 讨论
参考文献
创新和不足之处
致谢
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本文编号：3956208