绵羊SP-A基因体外部分生物学功能的研究

发布时间：2024-04-24 04:55

　　目的:本实验在巴什拜羊和盘羊杂交羊SP-A基因表达和纯化的基础上,研究重组SP-A蛋白(rSP-A)对体外培养的绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)增殖、代谢的影响,对MO黏附作用的影响,以及对嗜酸性粒细胞(EOS)杀伤MO作用的影响。为研究rSP-A的体外生物学功能奠定基础。方法:(1)SP-A基因的表达及蛋白纯化:利用已构建好的巴什拜羊和盘羊杂交羊重组巴斯德毕赤酵母GS115/pPIC9K-SP-A阳性克隆株,甲醇诱导表达96 h,采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳检测目的蛋白。(2)rSP-A对MO增殖的影响:将不同浓度(10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)巴什拜羊和盘羊杂交羊的rSP-A添加于MO培养液中进行体外培养,采用平板菌落计数法观察MO菌落数,实时荧光定量PCR法检测MO 16S rRNA表达量。(3)rSP-A对MO代谢的影响:将不同浓度两种羊的rSP-A添加于MO培养液中进行体外培养,于1 d、3 d、5 d、7 d收集培养液,使用酸化法检测培养液在550nm的吸光值(OD₅₅₀

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
主要略缩词
第一章 绪论
    一、目的与意义
    二、文献综述
        1.SP-A的研究进展
        2.绵羊肺炎支原体概述
        3.巴什拜羊与盘羊杂交羊生物学特性
        4.黏附素P113 的概述
        5.SP-A与嗜酸性粒细胞的作用
    三、研究内容
第二章 试验部分
    试验Ⅰ巴什拜羊与盘羊杂交羊SP-A基因的真核表达及纯化
        1.材料和方法
            1.1 材料
            1.2 实验方法
        2.结果
        3.讨论
    试验Ⅱ巴什拜羊、盘羊杂交羊重组SP-A蛋白对体外培养MO增殖的影响
        1.材料和方法
            1.1 材料
            1.2 平板菌落计数测定r SP-A对 MO生长的影响
            1.3 荧光定量PCR检测SP-A对 MO16S rRNA增殖的影响
            1.4 数据处理
        2.结果
            2.1 平板菌落计数结果
            2.2 MO16S rRNA基因扩增结果
            2.3 质粒PCR结果
            2.4 标准曲线的建立
            2.5 实时荧光定量PCR检测曲线结果
            2.6 MO16S rRNA表达量结果
        3.讨论
    试验Ⅲ 巴什拜羊和盘羊杂交羊重组SP-A蛋白对体外培养的MO代谢的影响
        1.材料和方法
            1.1 实验材料
            1.2 酸化测定SP-A对 MO代谢的作用
            1.3 数据处理
        2.结果
        3.讨论
    试验Ⅳ 巴什拜羊和盘羊杂交羊重组SP-A蛋白对体外培养的MO黏附的影响
        1.材料与方法
            1.1 材料
            1.2 半数颜色变化单位法测定r SP-A对 MO黏附率的影响
            1.3 荧光定量法测定r SP-A对 MO黏附素P113 的影响
            1.4 数据处理
        2.结果
            2.1 细胞培养结果
            2.2 颜色变化单位法对MO黏附率的影响结果
            2.3 荧光定量PCR检测P113 相对表达量结果
        3.讨论
    试验Ⅴ巴什拜羊和盘羊杂交羊r SP-A蛋白对嗜酸性粒细胞杀伤MO的影响
        1.材料与方法
            1.1 材料
            1.2 嗜酸性粒细胞的分离
            1.3 重组SP-A蛋白对嗜酸性粒细胞杀伤MO的影响
            1.4 数据处理
        2.结果
            2.1 嗜酸性粒细胞分离结果
            2.2 重组SP-A蛋白对嗜酸性粒细胞杀伤MO的结果
        3.讨论
第三章 全文总结
创新点
参考文献
附录
    1.培养基制备
    2.SDS-PAGE电泳所需试剂配制
    3.分离嗜酸性粒细胞所需溶液的制备
致谢
作者简介
导师评阅表



本文编号：3963263