西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

发布时间：2024-04-28 02:46

　　利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。

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【部分图文】：

图1PCR扩增的WNVE基因的鉴定

PCR扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，在1200bp处出现1条很亮的特异性目的条带（见图1），与目的片段大小一致。2.2重组质粒的构建与鉴定

图2重组表达质粒pET-30a(+)-WNV-E的PCR鉴定

将酶切后的目的片段与pET-30a（+）片段进行连接，连接产物转化至感受态HST08，提取重组质粒，进行PCR鉴定，经10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，可见1200bp的目的片段。基因测序结果与GenBank中收录的基因序列的同源性为100%，表明目的基因已被正确插入（见图2）....

图3目的蛋白诱导表达产物的Western-blot鉴定

将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3）感受态细胞中，用IPTG进行目的蛋白的诱导表达，表达产物经SDS-PAGE，转至NC膜，以小鼠源His单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗进行Western-blot鉴定，结果（见图3）显示，在44ku处出现特异性目的条....

图4不同温度诱导重组蛋白表达产物的SDS-PAGE分析

感染重组杆状病毒rBacmid-E的Sf9细胞出现特异性荧光（见图9A），而正常的Sf9细胞未出现荧光（见图9B），表明小鼠体内产生的抗WNVE蛋白多克隆抗体能够特异性识别E蛋白，证明E蛋白具有良好的免疫原性。图5不同诱导浓度表达的重组蛋白的SDS-PAGE分析

本文编号：3966057