O型FMD固相竞争ELISA及双抗夹心ELISA方法的建立与应用

发布时间：2017-05-26 15:25

  本文关键词：O型FMD固相竞争ELISA及双抗夹心ELISA方法的建立与应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是引起偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病,严重影响世界畜牧业的发展。发达国家防控FMD主要是捕杀感染动物,我国对FMD的防控措施主要是疫苗免疫,FMD的快速诊断对FMD的防控至关重要。为了能快速特异性诊断FMD,本研究制备到O型FMDV的单克隆抗体,通过大量制备腹水,并将抗体纯化和标记HRP,命名为2B5-HRP。应用2B5-HRP建立固相竞争ELISA(SPCE)检测方法,结果表明,成功制备到针对O型FMDV的特异性单抗,SPCE检测血清的最佳稀释度为1:8,PI=40为反应的临界值。敏感性和特异性是评价诊断方法的重要指标,用180份FMD阳性血清检测SPCE的敏感性,其中176份为阳性,敏感性为97.8%。特异性试验检测273份FMD阴性血清,其中268份为阴性,特异性为98.2%。SPCE与LPB-ELISA、VDPro及PrioCHECK的符合率均高于95%。批内和批间重复试验良好,SPCE和LPB-ELISA检测免疫动物抗体水平基本相符。本试验建立的SPCE方法的敏感性和特异性较好,能特异性诊断O型FMD,可用于FMD的规模化检测,为FMD的流行病学调查提供了新的手段。为了建立快速特异性检测O型FMDV方法,本研究以O型兔抗为包被抗原,以单抗2B5-HRP的检测抗体建立了双抗夹心ELISA检测方法。特异性结果显示,建立的ELISA方法与猪水疱病病毒、A型和Asia-I型FMDV均无交叉性反应。敏感性结果与rRT-PCR检测结果相符,批内和批间重复性好。本试验建立的双抗夹心ELISA检测方法可用O型FMDV的检测,为FMDV的流行病学调查和控制提供了技术手段。
【关键词】：单克隆抗体 固相竞争ELISA 双抗夹心ELISA 特异性 敏感性
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要2-3
• ABSTRACT3-6
• 缩略语表6-7
• 第一章 绪论7-18
• 1 国内外研究进展8-18
• 1.1 口蹄疫及其危害8
• 1.2 FMDV的结构8-9
• 1.3 口蹄疫检测方法9-13
• 1.4 FMD的预防13-16
• 1.5 单克隆抗体16-18
• 第二章 O型口蹄疫单克隆抗体的制备、纯化及HRP的标记18-26
• 1 材料18
• 1.1 实验动物、抗原及细胞18
• 1.2 主要试剂18
• 1.3 主要仪器18
• 2 方法18-22
• 2.1 杂交瘤细胞的复苏19
• 2.2 单克隆抗体的大量制备19
• 2.3 腹水特异性的检测19-20
• 2.4 腹水的纯化20
• 2.5 2B5单抗抗原谱分析20-21
• 2.6 HRP标记纯化的McAb21
• 2.7 标记后McAb特异性及效价的检测21-22
• 3 结果22-25
• 3.1 检测腹水特异性结果22-23
• 3.2 2B5抗原谱分析23
• 3.3 纯化后 2B5单抗的SDS-PAGE分析23-25
• 4 讨论25-26
• 第三章 2B5单抗竞争ELISA方法的建立26-38
• 1 材料26-27
• 1.1 血清26
• 1.2 相关试剂盒26
• 1.3 主要试剂26
• 1.4 主要仪器26-27
• 2 方法27-29
• 2.1 兔抗的制备27
• 2.2 试剂的最佳使用浓度的滴定27-28
• 2.3 固相竞争ELISA的操作步骤28
• 2.4 O型液相阻断ELISA检测试剂盒操作步骤28-29
• 2.5 VDPro~® FMDV Type O ELISA试剂盒操作步骤29
• 2.6 PrioCHECK~® FMDV type O试剂盒操作步骤29
• 3 结果29-35
• 3.1 各试剂最佳使用浓度的确定29-30
• 3.2 SPCE临界值的确定30-31
• 3.3 SPCE的重复性31-32
• 3.4 固相竞争ELISA检测的符合率32-33
• 3.5 固相竞争ELISA的特异性33
• 3.6 SPCE测定口蹄疫抗体33-35
• 4 讨论35-38
• 第四章 双抗夹心ELISA方法的建立38-43
• 1 材料38
• 1.1 组织液38
• 1.2 主要试剂38
• 2 方法38-39
• 2.1 双抗夹心ELISA操作流程38-39
• 2.2 筛选封闭液39
• 2.3 双抗夹心ELISA判定标准的确定39
• 3 结果39-41
• 3.1 筛选封闭液39-40
• 3.2 双抗夹心ELISA各试剂最佳稀释度的确定40
• 3.3 特异性试验40
• 3.4 敏感性试验40
• 3.5 重复性试验40-41
• 3.6 双抗夹心 ELISA 与 rRT-PCR 的符合率41
• 4 讨论41-43
• 全文结论43-44
• 参考文献44-49
• 致谢49-50
• 作者简介50-51
• 导师简介51-52

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本文编号：397290