牛miR-30-5p在骨骼肌中的表达与功能研究

发布时间：2017-05-27 02:07

  本文关键词：牛miR-30-5p在骨骼肌中的表达与功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一类长度只有22个左右核苷酸的单链非编码RNA。现已表明,miRNA在肌肉的生长发育过程中也发挥着关键性的作用。TargetScan预测MBNL基因家族为miR-30-5p靶基因。MBNL蛋白家族成员均为可变剪切调控因子,其中MBNL1能够使肌肉相关基因INSR的mRNA中exon11和Trim55的mRNA中的exon9在转录过程中不被切掉,而INSR被发现能够参与到与肌肉发育有关的信号通路中。MBNL1和MBNL3被报道在肌肉发育过程中具有重要的功能。本研究通过生物信息学的方法分析了miR-30-5p中的三个成员的在染色体上的位置及其相互间的保守性以及各自物种间的保守性。利用qPCR、Western Blot、siRNA干扰及双荧光素酶报告载体系统的方法分别研究了mi R-30-5p在牛心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌和脂肪等组织中的表达谱、其在肌肉分化中的作用,验证了其与其靶基因MBNL之间的靶向关系、分析了MBNL1对肌肉分化的影响,探究了miR-30-5p对MBNL1下游基因INSR和Trim55基因可变剪切的影响。本研究的实验结果如下:(1)通过序列保守性分析,发现miR-30a-5p、miR-30b-5p和miR-30e-5p之间以及它们在人、小鼠和牛的物种间的保守性都很高;(2)胎牛、犊牛和成年牛不同组织(心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌和脂肪)的表达谱分析结果显示,miR-30-5p在心、肺、肾和骨骼肌中表达量较高,且miR-30b-5p在胎牛、犊牛和成年牛之间的表达量有显著性的差异(p0.05),显示了miR-30-5p在肌肉发育过程中所具有的重要作用;(3)成功构建了mi R-30a-5p、miR-30b-5p和miR-30e-5p的pcDNA3.1(+)的过表达载体,成功构建了MBNL1、MBNL2和MBNL3的3’UTR片段的荧光素酶报告载体及其突变型载体;(4)在C2C12细胞中过表达miR-30-5p,发现肌肉分化标记分子MyoG和MHC的mRNA表达量显著下降(p0.05),Western Blot实验证明MyoG和MHC的蛋白表达量也得到抑制,标记分子的表达量被下调充分证明了,miR-30-5p能够抑制肌肉的分化;(5)双荧光素酶报告实验和Western Blot的实验结果证实了这一预测结果,即mi R-30a-5p和miR-30e-5p能够下调MBNL1、MBNL2和MBNL3基因的表达量(p0.05),mi R-30b-5p能够下调MBNL1和MBNL2的表达量(p0.05);(6)RNAi实验中,MyoG和MHC的mRNA(p0.05)和蛋白水平均被下调,证明了MBNL1能够促进肌肉的分化;(7)mi R-30-5p过表达载体转染C2C12细胞后,qPCR检测发现INSR的exon11和Trim55的exon9的表达量下降(p0.05),证明了该miR-30-5p能够促进INSR的成熟mRNA中exon11的缺失,促进Trim55成熟mRNA中exon9的缺失。综上所述,mi R-30-5p能够靶向下调MBNL的表达量,进而能够抑制肌肉的分化。
【关键词】：牛 miR-30-5p 肌肉分化 MBNL 可变剪切
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文献综述13-25
• 第一章 骨骼肌发育概述13-19
• 1.1 骨骼肌的发育13
• 1.2 骨骼肌生长发育相关通路13-16
• 1.2.1 肌肉的肥大14
• 1.2.2 PI3K/Akt信号通路14
• 1.2.3 EPK信号通路14
• 1.2.4 mTOR-S6K信号通路14-16
• 1.3 骨骼肌的病理研究16
• 1.4 骨骼肌发育相关基因MBNL研究进展16-19
• 第二章 MicroRNA （mi RNA）研究进展19-25
• 2.1 mi RNA的表达19
• 2.2 mi RNA的转录19-20
• 2.3 mi RNA的成熟20-21
• 2.4 RISC的装配21
• 2.5 mRNA的降解和蛋白质翻译过程的抑制21-22
• 2.6 mi RNA对肌肉发育的影响22
• 2.7 mi RNA的定量检测22-23
• 2.8 miR-30的研究进展23-24
• 本研究的目的意义24-25
• 实验部分25-65
• 第三章 miR305p表达谱的研究25-32
• 3.1 实验材料25
• 3.2 实验仪器与设备25
• 3.3 试剂及试剂盒25
• 3.4 实验方法25-26
• 3.4.1 miR305p的生物信息学分析25
• 3.4.2 miR305p在胎牛、犊牛和成年牛各组织中的表达25-26
• 3.5 结果与分析26-30
• 3.5.1 miR305p的生物信息学分析26-28
• 3.5.1.1 1miR-30-5pp在基因组组位置分析26-27
• 3.5.1.2 miR305p各成员间保守性分析27
• 3.5.1.3 miR305p物种间保守性分析27-28
• 3.5.2 miR305p的表达谱研究28-30
• 3.6 讨论30-31
• 3.7 小结31-32
• 第四章 miR305p对骨骼肌肌肉分化的影响32-40
• 4.1 实验材料32
• 4.2 实验仪器与设备32
• 4.3 试剂及试剂盒32
• 4.4 实验方法32-36
• 4.4.1 构建mi R305p过表达载体32-34
• 4.4.2 miR305p前体PCDNA3.1（+）载体构建34-35
• 4.4.3 miR305p对肌肉分化影响的研究35-36
• 4.5 结果与分析36-39
• 4.5.1 pre-miR305p过表达载体pcDNA3.1（+）的构建36-38
• 4.5.2 miR305p过表达载体表达成熟miRNA能力的检测38
• 4.5.3 miR305p对肌肉分化的影响38-39
• 4.6 讨论39
• 4.7 小结39-40
• 第五章 miR305p直接靶向MBNL40-61
• 5.1 实验材料40
• 5.2 实验仪器与设备40
• 5.3 试剂及试剂盒40
• 5.4 实验方法40-46
• 5.4.1 miR305p与MBNL表达量的相关关系40
• 5.4.2 双荧光素酶实验40-44
• 5.4.3 MBNL基因mRNA及蛋白的表达量：44-45
• 5.4.4 MBNL1促进肌肉分化45-46
• 5.5 结果与分析46-58
• 5.5.1 miR305p与MBNL表达量的相关关系46-49
• 5.5.2 MBNL 3’UTR的双荧光素酶报告载体的构建49-50
• 5.5.3 MBNL3’UTR突变型荧光报告载体载体构建50-52
• 5.5.4 miR305p直接靶向MBNL152-54
• 5.5.5 miR305p直接靶向MBNL254-56
• 5.5.6 miR305p直接靶向MBNL356-57
• 5.5.7 MBNL1促进肌肉分化57-58
• 5.6 讨论58-60
• 5.7 小结60-61
• 第六章 miR305p调节INSR和Trim55的可变剪切61-65
• 6.1 实验材料61
• 6.2 实验仪器与设备61
• 6.3 试剂及试剂盒61
• 6.4 实验方法61-62
• 6.4.1 细胞培养与转染61
• 6.4.2 定量检测INSR和Trim55的mRNA表达量61-62
• 6.5 结果与分析62-63
• 6.6 讨论63-64
• 6.7 小结64-65
• 结论与创新点65-66
• 结论65
• 创新点65-66
• 参考文献66-74
• 附录74-81
• 致谢81-82
• 作者简介82

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 曹爱玲;曾卫东;张才乔;;鸡胚骨骼肌细胞增殖和融合培养模型的建立[J];中国畜牧杂志;2006年09期

2 张燕军;韩志玲;张文广;李金泉;;骨骼肌发育及其相关miRNA表达机制的研究进展[J];中国畜牧兽医;2014年03期

3 赵晓;莫德林;张悦;龚雯;李安宁;陈瑶生;;猪的骨骼肌生长发育研究进展[J];生命科学;2011年01期

4 曹璐;吴德;方正锋;林燕;李勇;;白介素15对骨骼肌和脂肪组织的调节作用[J];动物营养学报;2010年02期

5 张勇;马勇;朱宇旌;邵彩梅;;p38丝裂原活化蛋白激酶信号途径调节骨骼肌生长发育的机理[J];动物营养学报;2012年01期

6 朱丹丹;高学军;严云勤;刘晓飞;陆黎敏;;牛骨骼肌特异性启动子的筛选[J];中国畜牧兽医;2011年03期

7 朱宇旌;于治姣;张勇;李艳;邵彩梅;;FoxO转录因子的活性调控及其对骨骼肌生长发育的调节[J];动物营养学报;2013年04期

8 丁国杰;刘娣;刘琦;;利用乌鸡胚胎培养骨骼肌细胞的研究[J];黑龙江畜牧兽医;2006年05期

9 王勇;李莉;沈明华;荆海霞;张勤文;;高海拔地区牦牛心肌骨骼肌ATP酶活性的测定[J];中国兽医杂志;2012年10期

10 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 白跃宏;欧阳颀;杨远滨;张龙海;刘树清;;慢性骨筋膜室综合征动物模型的建立及骨骼肌病理变化的实验研究[A];全国软组织疼痛微创技术专题研讨会论文汇编[C];2004年

2 张学林;高晓娟;史冀鹏;王瑞元;;骨骼肌超微结构损伤累积与过劳性损伤关系的研究[A];2011年中国生理学会运动生理学专业委员会会议暨“运动与骨骼肌”学术研讨会论文集[C];2011年

3 孟艳;翁锡全;林文_";何晓龙;;间歇性爬坡运动对老年鼠骨骼肌卫星细胞激活通路中NO-NOS表达的影响[A];第九届全国体育科学大会论文摘要汇编(4)[C];2011年

4 刘健;黄梅;;Ⅱ型糖原蓄积病患者骨骼肌的超微结构观察[A];第八次全国电子显微学会议论文摘要集（Ⅰ）[C];1994年

5 白跃宏;欧阳颀;杨远滨;张龙海;刘树清;;慢性骨筋膜室综合征动物模型的建立及骨骼肌病理变化的实验研究[A];第九届全国软组织疼痛学术会议暨首届中华医学会疼痛学会软组织疼痛年会论文汇编[C];2004年

6 任振义;叶健;;COPD过氧化应激所致的骨骼肌功能障碍[A];2006年浙江省呼吸系病学术年会论文汇编[C];2006年

7 宋淑华;熊开宇;;离子浓度改变对骨骼肌膜电位和骨骼肌疲劳的研究进展[A];2007全国运动生理学论文报告会论文集[C];2007年

8 任振义;;COPD过氧化应激所致的骨骼肌功能障碍[A];浙江省中西医结合呼吸病诊治进展暨第五次学术年会论文汇编[C];2006年

9 赖颢;赵强;虞勇;王克强;;体外共同培养的鼠骨骼肌成肌细胞与心肌细胞间连接的形态研究[A];第八届华东六省一市胸心血管外科学术会议论文汇编[C];2005年

10 苏冠华;刘启云;卢永昕;米少华;孙雨霏;刘晓明;帅欣欣;;犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培养方法改良探索[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 张伟;绵羊骨骼肌高表达miRNA靶基因的高通量获取及部分候选靶基因生物功能研究[D];石河子大学;2015年

2 王文汇;血管紧张素Ⅱ受体与骨骼肌微循环胰岛素抵抗[D];山东大学;2012年

3 吕元军;吡格列酮对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏和骨骼肌免疫损伤的治疗作用[D];天津医科大学;2009年

4 李爱春;富氢水对骨骼肌运动性氧化应激损伤与选择性抗氧化作用机制研究[D];苏州大学;2012年

5 高前进;骨骼肌热休克蛋白保护作用及机制研究[D];北京体育大学;2006年

6 朱海燕;参芪复方对KKAy小鼠糖尿病大血管病变骨骼肌差异基因表达影响的实验研究[D];成都中医药大学;2013年

7 李金茹;缺氧的脂肪细胞与巨噬细胞条件培养基对骨骼肌细胞胰岛素作用的影响[D];天津医科大学;2010年

8 彭保卫;电脉冲介导的DNA疫苗骨骼肌内免疫接种的转基因长期表达和抗原递呈机理的研究[D];上海交通大学;2006年

9 孙婧瑜;CD36对骨骼肌脂肪酸代谢调控的机制研究[D];华东师范大学;2014年

10 高宇;高脂饮食老年大鼠骨骼肌脂肪酸转运与IR相关机制及药物干预的研究[D];河北医科大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 田铁英;机械通气对COPD患者骨骼肌基因及泛素系统相关蛋白表达的影响[D];内蒙古大学;2015年

2 程小芳;低蛋白日粮平衡氨基酸对断奶仔猪骨骼肌生长相关蛋白质表达规律的研究[D];华中农业大学;2015年

3 秦庚;长非编码RNA Rian/Irm在骨骼肌发育中的功能初步研究[D];哈尔滨工业大学;2015年

4 贾青;脂联素调控肉鸡骨骼肌脂肪代谢的机制研究[D];山东农业大学;2015年

5 朱晓翠;PKC和Rab GTPase在钙信号调节骨骼肌细胞GLUT4胞内运输机制中的作用[D];天津医科大学;2015年

6 孟庆敏;Ⅱ型HDAC5对大鼠骨骼肌GLUT4蛋白表达影响的研究[D];成都体育学院;2015年

7 祁翔;亮氨酸补充对老龄大鼠骨骼肌生长的影响及机理探讨[D];上海体育学院;2015年

8 李喜凤;住院老年患者骨骼肌减少与骨密度的关系[D];重庆医科大学;2015年

9 谭娅;猪心肌和骨骼肌microRNA表达谱分析与比较[D];四川农业大学;2014年

10 张博文;牛miR-30-5p在骨骼肌中的表达与功能研究[D];西北农林科技大学;2016年

  本文关键词：牛miR-30-5p在骨骼肌中的表达与功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：398596