TolC在肠外致病性大肠杆菌中的生物学功能研究

发布时间：2024-05-17 16:49

　　肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC)是一类人兽共患病病原菌,感染后可以引起人和动物的一系列临床症状。其中典型的肠外感染包括尿道、生殖道感染、中枢神经系统感染、循环系统和呼吸系统感染,并且感染数量逐年上升,增加了医疗成本,动物生产力下降,给社会带来了沉重的经济负担。细菌多重耐药性和生物被膜的形成,以及缺乏有效保护的疫苗,均使ExPEC的防控更加困难。在许多革兰氏阴性菌细胞膜中,均发现有多药抗性外排系统的存在,与临床细菌多重耐药性相关。多药抗性外排泵(Multidrug-resistance efflux pumps)由三组分构成：位于细胞膜内膜上的转运蛋白、位于周质间隙中的辅助蛋白、位于细胞膜外膜上的外膜蛋白,三者形成一个三聚体,由质子泵势能供能而发挥作用。耐大肠菌素TolC (Tolerant colicin)外膜蛋白是组成革兰氏阴性菌多药抗性外排泵的最重要的组成成分,参与许多不同家族外排泵的形成,介导多重耐药性的产生。近年来有研究表明TolC蛋白参与细菌的毒力和生物被膜的形成,并可参与细菌自身代谢产...

【文章页数】：139 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词(ABBREVIATION)
第一章 文献综述
    1.1 肠外致病性大肠杆菌(EXPEC)病原学研究进展
        1.1.1 大肠杆菌简介
        1.1.2 大肠杆菌的分群
        1.1.3 大肠杆菌分型
        1.1.4 ExPEC的毒力(相关)因子
        1.1.5 ExPEC的致病机理
        1.1.6 ExPEC的感染临床症状和病理变化
        1.1.7 ExPEC感染的流行病学分析
        1.1.8 ExPEC的诊断、预防和治疗
    1.2 大肠杆菌生物被膜研究进展
        1.2.1 细菌生物被膜概述
        1.2.2 生物被膜的危害
        1.2.3 大肠杆菌生物被膜形成相关因子的研究
        1.2.4 生物被膜细菌与悬浮细菌的生物学比较
        1.2.5 生物被膜的控制和消除
        1.2.6 展望或结语
    1.3 细菌多药外排泵研究进展
        1.3.1 前言
        1.3.2 多药外排泵的组成
        1.3.3 多药外排泵的调控研究进展
        1.3.4 多药外排泵AcrAB-TolC在细菌生理活动中的作用
        1.3.5 多药外排泵抑制剂研究进展
        1.3.6 多重耐药外排泵研究展望
    1.4 本研究的目的和意义
第二章 TolC在ExPEC生物被膜形成中的功能研究
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 菌株与载体
        2.2.2 主要试剂、主要仪器和设备
        2.2.3 大肠杆菌χ7213感受态细胞的制备
        2.2.4 质粒的小量制备
        2.2.5 tolC缺失突变株及其回复补偿株的构建
            2.2.5.1 细菌基因组DNA的制备
            2.2.5.2 PCR引物设计与合成
            2.2.5.3 缺失突变株的构建
            2.2.5.4 tolC回复补偿株的构建
        2.2.6 细菌生长曲线的测定
        2.2.7 试验菌株对抗菌药物最小抑菌浓度的测定(MIC测定)
        2.2.8 细菌生物被膜形成能力的测定
        2.2.9 细菌运动性的测定
        2.2.10 生物被膜细菌在扫描电子显微镜下形态观察
        2.2.11 细菌curli菌毛和纤维素生物合成能力的测定
        2.2.12 不同渗透压对试验菌株生物被膜形成能力的影响
        2.2.13 不同培养基成分对试验菌株生物被膜形成能力的影响
        2.2.14 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测试验菌株基因的转录水平
            2.2.14.1 细菌RNA的提取
            2.2.14.2 逆转录反应
            2.2.14.3 实时荧光定量PCR
        2.2.15 细菌外膜完整性的透射电镜(TEM)观察
        2.2.16 TRANS-WELL试验
        2.2.17 CpxR,OmpR,TolC缺失株的生物被膜形成能力比较
    2.3. 结果与分析
        2.3.1 缺失株和回补株的构建
        2.3.2 MIC测定
        2.3.3 生长曲线
        2.3.4 WT和ΔtolC菌株生物被膜形成能力比较
        2.3.5 M9培养基中curli菌毛和cellulose生物合成能力的比较
        2.3.6 电子扫描显微镜(SEM)下细菌表面形态的比较
        2.3.7 1/2M9培养基中生物被膜的形成能力、curli形成能力的比较
        2.3.8 在不同培养基成分中生物被膜形成能力的比较
        2.3.9 不同氯化钠和蔗糖浓度对生物被膜形成的影响
        2.3.10 qRT-PCR检测curli和cellulose合成相关基因的表达
        2.3.11 细菌外膜完整性的比较
        2.3.12 Trans-well
        2.3.13 CpxR及OmpR缺失株与TolC缺失株生物被膜形成能力的比较
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
第三章 TolC缺失对ExPEC致病性的影响
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 菌株、细胞和培养基
        3.2.2 主要仪器和设备
        3.2.3 主要试剂
        3.2.4 curli形成能力的比较
        3.2.5 细胞感染实验中细菌的准备
        3.2.6 细菌的细胞粘附和侵袭试验
        3.2.7 细菌在巨噬细胞存活试验
        3.2.9 小鼠感染试验
        3.2.10 组织病理学观察
        3.2.11 蛋白质组学比较
            3.2.11.1 菌体的培养与及破碎
            3.2.11.2 膜蛋白的提取
            3.2.11.3 蛋白定量
            3.2.11.4 双向电泳
            3.2.11.5 凝胶染色
            3.2.11.6 凝胶图像扫描
            3.2.11.7 胶内酶解及Ziptip脱盐
            3.2.11.8 MaWi-TOF-TOF
    3.3 结果与分析
        3.3.1 curli菌毛形成能力的比较
        3.3.2 ΔtolC株对上皮细胞和巨噬细胞的粘附和侵袭能力下降
        3.3.3 ΔtolC株在巨噬细胞中的存活能力下降
        3.3.4 ΔtolC株在小鼠感染试验中毒力下降
        3.3.5 组织病理学损伤比较
        3.3.6 WT菌株与ΔtolC株的外膜蛋白质组学比较
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
第四章 TolC缺失对ExPEC在高渗环境下存活能力的影响
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株和培养
        4.2.2 TolC缺失对ExPEC在高浓度的NaCl和蔗糖下存活能力的影响
        4.2.3 外排泵抑制剂CCCP对ExPEC在高渗环境下存活能力的影响
        4.2.4 CCCP对ExPEC生物被膜形成的影响
        4.2.5 活菌计数
        4.2.6 统计分析
    4.3 结果
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
全文总结
参考文献
已发表文章
附录：个人简历
致谢



本文编号：3975849