猪巨细胞病毒gB蛋白间接ELISA方法的建立及单克隆抗体的制备与鉴定

发布时间：2024-06-28 02:48

　　猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV)是一种有囊膜的双股线性DNA病毒,可以导致胚胎死亡、仔猪鼻炎、矮小、肺炎和增重缓慢等症状,成年猪一般呈隐性感染,不表现临床症状。PCMV主要蛋白有糖蛋白B、衣壳蛋白和DNA聚合酶蛋白。gB蛋白是PCMV的必需糖蛋白和重要免疫原,在病毒侵染宿主细胞的黏附、融合和进入细胞以及在细胞问的转移过程中发挥重要作用,同时gB蛋白作为主要的保护性抗原,可以诱导机体产生特异性免疫应答。本研究通过基因重组技术获得重组gB蛋白,将纯化的gB蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于PCMV抗体的检测和血清学调查。同时,将gB蛋白免疫小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备gB蛋白的单克隆抗体,为PCMV诊断和致病机理的研究奠定基础。具体内容如下： 1.猪巨细胞病毒gB基因原核表达与鉴定 采用PCR方法从PCMV阳性组织病料中扩增gB基因,将其克隆至pET-32a载体。将鉴定正确的重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中,涂板挑选阳性单个克隆菌。经IPTG诱导表达后收集菌液进行SDS-PAGE电泳,原核表达产物大小约为40KDa。表达产物...

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一篇 文献综述
    1 生物学特性与病毒蛋白
        1.1 病毒生物学特性
        1.2 病毒主要蛋白
    2 流行病学
    3 临床特征和病理变化
    4 诊断技术
        4.1 电镜观察
        4.2 酶联免疫吸附试验
        4.3 间接免疫荧光试验
        4.4 免疫组织化学技术
        4.5 分子诊断
            4.5.1 PCR
            4.5.2 原位杂交技术
    5 预防与控制
    参考文献
第二篇 研究内容
    第一章 猪巨细胞病毒gB基因原核表达与鉴定
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 PCMV gB基因的PCR扩增
                1.2.2 PCR产物回收纯化
                1.2.3 重组质粒的构建及鉴定
                1.2.4 重组gB蛋白的表达
                1.2.5 表达gB蛋白的Western-blotting鉴定
        2 结果
            2.1 gB基因扩增
            2.2 重组质粒pET32a-gB双酶切鉴定
            2.3 gB基因序列测定
            2.4 重组gB蛋白的SDS-PAGE电泳结果
            2.5 表达产物的Western-blotting鉴定结果
        3 讨论
        参考文献
        ABSTRACT
    第二章 猪巨细胞病毒间接ELISA检测方法的建立与初步应用
        摘要
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
                1.2.1 重组gB蛋白表达条件的优化
                1.2.2 重组gB蛋白的可溶性鉴定
                1.2.3 重组gB蛋白的纯化
                1.2.4 间接ELISA方法的建立及条件优化
                1.2.5 间接ELISA阴阳性判定标准的建立
                1.2.6 特异性试验
                1.2.7 敏感性试验
                1.2.8 重复性试验
                1.2.9 临床血清样品检测
        2 结果
            2.1 ELISA抗原制备
                2.1.1 重组gB蛋白表达条件优化
                2.1.2 重组gB蛋白可溶性检测
                2.1.3 重组gB蛋白的纯化
            2.2 间接ELISA方法反应条件优化
            2.3 间接ELISA方法阴阳性判定标准的建立
            2.4 特异性试验
            2.5 敏感性试验
            2.6 重复性试验
            2.7 临床血清样品的检测
        3 讨论
        参考文献
        ABSTRACT
    第三章 抗猪巨细胞病毒gB蛋白单克隆抗体研制
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 主要材料与试剂
            1.2 抗原蛋白和检测蛋白的制备
            1.3 动物免疫
            1.4 间接ELISA方法检测免疫后鼠血清效价
            1.5 单抗的制备
                1.5.1 SP2/0骨髓瘤细胞的准备
                1.5.2 饲养细胞的准备
                1.5.3 脾淋巴细胞的准备
                1.5.4 细胞融合
                1.5.5 杂交瘤细胞的选择性培养
                1.5.6 阳性杂交瘤细胞的筛选
                1.5.7 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
                1.5.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏
                1.5.9 腹水的制备
            1.6 单克隆抗体的鉴定
                1.6.1 单克隆抗体效价的测定
                1.6.2 单克隆抗体Ig类的鉴定
                1.6.3 单克隆抗体的特异性鉴定
                1.6.4 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性的鉴定
        2 结果
            2.1 杂交瘤细胞株的建立和抗体效价的测定
            2.2 单克隆抗体的Ig类鉴定
            2.3 单克隆抗体的特异性鉴定
                2.3.1 单克隆抗体与原核表达的蛋白的反应
                2.3.2 单克隆抗体与真核表达的蛋白的反应
            2.4 分泌抗体稳定性的鉴定
        3 讨论
        参考文献
        ABSTRACT
全文总结
附录
致谢



本文编号：3996324