绵羊间充质干细胞系的建立及用作体细胞克隆供体的研究
发布时间：2024-12-07 03:27
自世界首例哺乳动物体细胞克隆羊“多利”培育成功至今,体细胞核移植技术得到日益发展。体细胞克隆中,供体细胞的选择是克隆能否成功的关键因素之一,直接影响到体细胞克隆的效率。迄今为止,已有多种体细胞如各类成纤维细胞、乳腺上皮细胞、生殖系统细胞、淋巴细胞等用作核供体进行哺乳动物体细胞克隆,均获得了成功,但普遍存在克隆效率低、成本高的难题。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于中胚层的成体干细胞,广泛存在于全身结缔组织和器官间质中,具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能。以间充质干细胞为核供体进行体细胞克隆,在猪、牛和狗上已获得成功,在猪上表现出比常规成纤维细胞为供体的克隆效率高。迄今未见有绵羊的相关研究报道。 本文首先建立了绵羊脂肪和骨髓间充质干细胞系,对其生物学特征及干细胞特性进行了鉴定,诱导其分化为类神经元、心肌细胞、成骨细胞、成脂细胞和胰岛样细胞,经组织学染色和RT-PCR鉴定,确认表现、表达了各分化细胞特有的形态特征及特异基因。在此基础上,采用骨髓间充质干细胞替代常用的成纤维细胞为核供体,构建重构胚,以成纤维细胞为对照,比较了重构胚的早期发育能...
【文章页数】：146 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
插图清单
附表清单
缩略语表
1 引言
1.1 间充质干细胞的研究进展
1.1.1 间充质干细胞概述
1.1.2 间充质干细胞的生物学特性
1.1.3 间充质干细胞的多向诱导分化
1.2 间充质干细胞用作体细胞克隆供体的研究进展
1.2.1 哺乳动物体细胞克隆概述
1.2.2 体细胞核移植机理的研究
1.2.3 间充质干细胞用作供体细胞的研究进展
1.3 间充质干细胞的应用及存在问题
1.3.1 间充质干细胞的应用
1.3.2 间充质干细胞研究展望
1.4 本研究的目意义及主要内容
1.4.1 作为基础研究的理想种子细胞
1.4.2 作为动物体细胞克隆的供体细胞
1.4.3 主要研究内容
2 绵羊胎儿、幼龄及成年间充质干细胞的分离与培养
2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验仪器及耗材
2.1.4 实验方法
2.2 实验结果与分析
2.2.1 绵羊MSCs及SFCs体外培养特征
2.2.2 绵羊间充质干细胞的遗传稳定性
2.2.3 绵羊MSCs干细胞转录因子基因的检测
2.3 讨论
2.3.1 MSCs的分离与培养
2.3.2 绵羊MSCs的生物学特性
2.4 小结
3 绵羊间充质干细胞的多向诱导分化
3.1 材料与方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验试剂
3.1.3 实验仪器及耗材
3.1.4 实验方法
3.2 实验结果与分析
3.2.1 组织学染色结果
3.2.2 诱导分化的特异性表达基因鉴定
3.3 讨论
3.3.1 MSC向神经样细胞的诱导分化一
3.3.2 MSCs向心肌细胞的诱导分化
3.3.3 MSCs向骨细胞的诱导分化
3.3.4 MSCs向脂肪细胞的诱导分化
3.3.5 MSCs向胰岛样细胞的诱导分化
3.4 小结
4 以MSC为核供体的重构胚体外发育研究
4.1 材料与方法
4.1.1 实验材料
4.1.2 实验试剂
4.1.3 实验仪器及耗材
4.1.4 实验方法
4.2 实验结果与分析
4.2.1 绵羊胎儿成年MSCs和SFCs的培养
4.2.2 卵母细胞的体外成熟
4.2.3 克隆胚的构建
4.2.4 重构胚的体外发育
4.3 讨论
4.3.1 卵母细胞的体外成熟
4.3.2 供体细胞的准备
4.3.3 克隆胚胎的体外发育
4.4 小结
5 以BMSCs为核供体的克隆绵羊研究
5.1 材料与方法
5.1.1 实验材料
5.1.2 实验试剂
5.1.3 实验仪器及耗材
5.1.4 实验方法
5.2 实验结果
5.2.1 供体细胞的培养
5.2.2 卵母细胞的体外成熟
5.2.3 克隆胚的构建
5.2.4 克隆胚胎的发育与胚胎移植
5.2.5 成体干细胞克隆绵羊诞生
5.2.6 成体干细胞克隆羊的亲子鉴定
5.3 讨论
5.3.1 动物的胚胎移植
5.3.2 克隆羊的亲子鉴定
5.4 小结
6 结论
致谢
参考文献
附录
作者简介
本文编号：4014723
【文章页数】：146 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
插图清单
附表清单
缩略语表
1 引言
1.1 间充质干细胞的研究进展
1.1.1 间充质干细胞概述
1.1.2 间充质干细胞的生物学特性
1.1.3 间充质干细胞的多向诱导分化
1.2 间充质干细胞用作体细胞克隆供体的研究进展
1.2.1 哺乳动物体细胞克隆概述
1.2.2 体细胞核移植机理的研究
1.2.3 间充质干细胞用作供体细胞的研究进展
1.3 间充质干细胞的应用及存在问题
1.3.1 间充质干细胞的应用
1.3.2 间充质干细胞研究展望
1.4 本研究的目意义及主要内容
1.4.1 作为基础研究的理想种子细胞
1.4.2 作为动物体细胞克隆的供体细胞
1.4.3 主要研究内容
2 绵羊胎儿、幼龄及成年间充质干细胞的分离与培养
2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验仪器及耗材
2.1.4 实验方法
2.2 实验结果与分析
2.2.1 绵羊MSCs及SFCs体外培养特征
2.2.2 绵羊间充质干细胞的遗传稳定性
2.2.3 绵羊MSCs干细胞转录因子基因的检测
2.3 讨论
2.3.1 MSCs的分离与培养
2.3.2 绵羊MSCs的生物学特性
2.4 小结
3 绵羊间充质干细胞的多向诱导分化
3.1 材料与方法
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验试剂
3.1.3 实验仪器及耗材
3.1.4 实验方法
3.2 实验结果与分析
3.2.1 组织学染色结果
3.2.2 诱导分化的特异性表达基因鉴定
3.3 讨论
3.3.1 MSC向神经样细胞的诱导分化一
3.3.2 MSCs向心肌细胞的诱导分化
3.3.3 MSCs向骨细胞的诱导分化
3.3.4 MSCs向脂肪细胞的诱导分化
3.3.5 MSCs向胰岛样细胞的诱导分化
3.4 小结
4 以MSC为核供体的重构胚体外发育研究
4.1 材料与方法
4.1.1 实验材料
4.1.2 实验试剂
4.1.3 实验仪器及耗材
4.1.4 实验方法
4.2 实验结果与分析
4.2.1 绵羊胎儿成年MSCs和SFCs的培养
4.2.2 卵母细胞的体外成熟
4.2.3 克隆胚的构建
4.2.4 重构胚的体外发育
4.3 讨论
4.3.1 卵母细胞的体外成熟
4.3.2 供体细胞的准备
4.3.3 克隆胚胎的体外发育
4.4 小结
5 以BMSCs为核供体的克隆绵羊研究
5.1 材料与方法
5.1.1 实验材料
5.1.2 实验试剂
5.1.3 实验仪器及耗材
5.1.4 实验方法
5.2 实验结果
5.2.1 供体细胞的培养
5.2.2 卵母细胞的体外成熟
5.2.3 克隆胚的构建
5.2.4 克隆胚胎的发育与胚胎移植
5.2.5 成体干细胞克隆绵羊诞生
5.2.6 成体干细胞克隆羊的亲子鉴定
5.3 讨论
5.3.1 动物的胚胎移植
5.3.2 克隆羊的亲子鉴定
5.4 小结
6 结论
致谢
参考文献
附录
作者简介
本文编号：4014723
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