兔microRNA-18b生物信息学分析及其与CDK19的靶向验证

发布时间：2024-12-10 01:22

　　 为探究miR-18b对兔卵巢颗粒细胞增殖凋亡的作用及潜在调控靶点,利用生物信息学技术预测兔miRNA-18b(ocu-miR-18b)的靶基因及其可能参与的生物学过程。预测结果发现靶基因的功能注释分析显著富集在细胞增殖和凋亡的调控等过程,而其中CDK19可能是miR-18b的潜在靶基因。为验证假设,将扩增的野生型及突变型的CDK19 3'UTR序列分别克隆至荧光素酶报告载体中,与miR-18b的mimics(试验组)或mimics NC(对照组)共同转染至HEK293T细胞。通过双荧光素酶报告系统检测细胞的荧光素酶活性,鉴定miR-18b与CDK19 3'UTR的靶向关系。并且通过qRT-PCR检测miR-18b对靶基因的调控作用。结果表明:成功构建了CDK19基因3'UTR荧光素酶报告质粒,证明了miR-18b可以作用于CDK19基因3'UTR,抑制其荧光素酶活性。此外,qRT-PCR分析表明,miR-18b与CDK19表达模式相反。从而证明了miR-18b与CDK19的直接靶向关系,为更深入研究miR-18b与卵巢颗粒细胞的关系奠定基础。

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【部分图文】：

图1 miR-18b靶基因预测的文氏图

用miRWalk、ENCORI、miRanda分别预测到2398、2826、7306个miR-18b的靶基因,取三者的交集,获得332个靶基因(图1)。2.1.3靶基因预测GO分析

图2 miR-18b预测靶基因的GO注释

KEGG分析结果显示,miR-18b的靶基因集合显著富集于胞吞作用、调节干细胞多能性、癌症中的MicroRNA、癌症的途径、胰腺癌、TGF-β、内质网中的蛋白质加工、膀胱癌和PI3K-Akt等信号通路(P<0.05)(图3)。这些信号通路在细胞增殖和凋亡中发挥着重要的调控作用....

图3 miR-18b预测的靶基因pathway富集分析

图2miR-18b预测靶基因的GO注释2.2miR-18b特异性结合CDK19

图4 miR-18b直接靶向CDK19的3"UTR区

首先进行野生型(wt)和突变型(mt)载体的构建,然后将两组质粒载体分别与miR-18b的mimics或mimicsNC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。结果显示,wt+mimics组与wt+mimicsNC组的双荧光素酶活性相比显著降低,而mt组的活性无显著....

本文编号：4015379