鸭肠炎病毒gN基因及其功能的初步研究

发布时间：2024-12-10 22:51

　　根据本实验室构建的鸭肠炎病毒基因文库的序列信息,设计DEVgN基因的特异性引物,对DEV gN基因（GenBank登录号EU195112）进行PCR扩增,并分析了DEVgN基因的分子特征和密码子偏嗜性,并且开展了以下研究：gN基因在DEV感染鸭胚成纤维细胞过程中的转录时相,编码的gN蛋白在宿主DEF中的细胞定位以及gN蛋白与gM蛋白在宿主DEF中的共定位研究；在这些研究基础上,建立和优化了基于gN基因的DEV PCR诊断方法。获得的结果如下： 1. DEV gN基因的克隆及分子特征分析构建DEV gN基因的T克隆质粒（pUCm-T/gN）,该基因大小为288bp,编码蛋白为95aa。编码的gN蛋白含有一个保守区域,属于Herpes_UL49.5superfamily,含有1个信号肽区和2个跨膜区,5个磷酸化位点。亚细胞定位预测结果显示该蛋白66.7%存在于内质网。系统进化树表明DEVgN基因与α疱疹病毒亚科中CeHV-1gN基因和HSV-3gN基因的亲缘性最高；DEVgN蛋白在进化上与a疱疹病毒亚科中的MeHV-1gN蛋白亲缘性最高。 2. DEV gN基因的...

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【学位级别】：硕士

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中文摘要
ABSTRACT
第一部分 文献综述
    第一章 疱疹病毒gN基因及其编码蛋白的研究进展
        1 引言
        2 疱疹病毒gN基因及其编码蛋白的特点
            2.1 疱疹病毒gN基因的特点
            2.2 疱疹病毒gN蛋白的特点
        3 疱疹病毒gN蛋白的功能
            3.1 在抗原呈递过程中的病毒免疫逃避作用
            3.2 与gM蛋白作用发挥重要功能
                3.2.1 糖蛋白复合物gM/gN的形成方式
                3.2.2 在蛋白成熟过程中与gM蛋白相互影响
                3.2.3 在病毒的复制、感染和细胞间感染中的作用
                3.2.4 糖蛋白复合物gM/gN抑制细胞融合
        4 选题目的和意义
第二部分 试验研究
    第二章 鸭肠炎病毒gN基因的克隆及其分子特征分析
        1 材料
            1.1 基因文库/菌株/毒株/载体
            1.2 实验动物
            1.3 主要试剂
            1.4 主要生物信息学分析软件
            1.5 主要仪器
        2 试验方法
            2.1 DEV gN基因的扩增
                2.1.1 鸭胚成纤维细胞的制备
                2.1.2 接种DEV
                2.1.3 DEV DNA的提取
                2.1.4 引物的设计与合成
                2.1.5 DEV gN基因的PCR扩增
            2.2 DEV gN基因的T克隆
                2.2.1 目的DNA片段的回收
                2.2.2 制备感受态细胞DH5α
                2.2.3 连接
                2.2.4 重组T克隆质粒转化感受态细胞DH5α
            2.3 重组T克隆质粒的鉴定
                2.3.1 重组T克隆质粒的酶切鉴定
                2.3.2 重组T克隆质粒的PCR鉴定
            2.4 DEV gN基因的生物信息学分析
                2.4.1 DEV gN基因序列的分子特性分析
                2.4.2 DEV gN蛋白序列的分子特性分析
        3 结果
            3.1 DEV gN基因的扩增
            3.2 DEV gN基因的T克隆质粒鉴定
            3.3 DEV gN基因的分子特征分析
            3.4 DEV gN蛋白的分子特征分析
                3.4.1 DEV gN蛋白的理化性质分析
                3.4.2 DEV gN蛋白的保守结构域预测
                3.4.3 DEV gN蛋白的信号肽及跨膜区的预测
                3.4.4 DEV gN蛋白的翻译后修饰位点的预测
                3.4.5 DEV gN蛋白的抗原性分析
                3.4.6 DEV gN蛋白的二级结构及三级结构的预测
                3.4.7 DEV gN蛋白的亚细胞定位预测
                3.4.8 DEV gN蛋白的相似性及系统进化分析
            3.5 DEV gN基因的密码子偏嗜性分析
        4 讨论
            4.1 关于DEV gN基因的引物设计及T克隆
            4.2 DEV gN基因及其编码蛋白的分子特征分析
            4.3 DEV gN基因的密码子偏嗜性分析
    第三章 鸭肠炎病毒gY基因在DEF中转录时相的研究
        1 材料与仪器
            1.1 材料
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 DEF的制备
            2.2 接种DEV
            2.3 RNA的提取及测定
            2.4 Real-time qRT-PCR检测DEV gN基因的转录时相
                2.4.1 样品cDNA的获得
                2.4.2 引物设计与合成
                2.4.3 引物特异性检测
                2.4.4 标准品的制备
                2.4.5 标准曲线的制作
                2.4.6 Real-time qRT-PCR反应
                2.4.7 数据统计分析
        3 结果
            3.1 引物特异性检测
            3.2 RNA完整性及纯度检测分析
            3.3 Real-time qRT-PCR标准曲线建立
            3.4 DEV gN基因在DEF中的定量检测
            3.5 数据处理
        4 讨论
            4.1 转录时相的研究方法
            4.2 标准曲线分析
            4.3 DEV gN基因的转录时相分析
    第四章 鸭肠炎病毒gN蛋白在DEF中的细胞定位分析
        1 材料
            1.1 毒株/质粒/试验动物
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 重组真核表达质粒的构建路线图
            2.2 重组真核表达质粒的构建
                2.2.1 引物设计与合成
                2.2.2 DEV gN基因片段和真核表达载体的酶切处理
                2.2.3 制备感受态细胞DH5α
                2.2.4 连接
                2.2.5 重组真核表达质粒转化感受态细胞DH5α
            2.3 重组真核表达质粒的鉴定
                2.3.1 重组真核表达质粒的酶切鉴定
                2.3.2 重组真核表达质粒的PCR鉴定
            2.4 DEF的制备
            2.5 转染试剂制备
            2.6 重组真核表达质粒转染DEF
            2.7 荧光信号检测
        3 结果
            3.1 重组表达质粒pEGFP-C1/gN的鉴定
            3.2 DEV gN蛋白的细胞定位
        4 讨论
            4.1 蛋白定位的研究方法
            4.2 DEV gN蛋白的细胞定位分析
    第五章 鸭肠炎病毒gN蛋白与gM蛋白的共定位分析
        1 材料
            1.1 毒株/质粒/试验动物
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 DEV gM基因的扩增
                2.1.1 引物设计与合成
                2.1.2 DEV gM基因的PCR扩增
            2.2 重组表达质粒pDsRed1-N1/gM的构建路线图
            2.3 DEV gM基因的重组表达质粒的构建
                2.3.1 制备感受态细胞DH5α
                2.3.2 DEV gM基因片段和真核表达载体的酶切处理
                2.3.3 连接
                2.3.4 重组真核表达质粒转化感受态细胞DH5α
            2.4 DEV gM基因的重组表达质粒的鉴定
                2.4.1 重组真核表达质粒的酶切鉴定
                2.4.2 重组真核表达质粒的PCR鉴定
            2.5 DEF的制备
            2.6 转染试剂的制备
            2.7 DEV gM蛋白在DEF中的细胞定位
            2.8 DEV gN与gM蛋白在DEF中的共定位
            2.9 荧光信号检测
        3 结果
            3.1 DEV gM基因的扩增
            3.3 重组表达质粒pDsRed1-N1/gM的鉴定
            3.4 DEV gM蛋白的细胞定位
            3.5 DEV gN蛋白与gM蛋白的共定位分析
        4 讨论
            4.1 蛋白之间相互作用的研究方法
            4.2 DEV gN蛋白与gM蛋白的共定位分析
    第六章 基于DEV gN基因的鸭肠炎病毒PCR诊断方法的建立与优化
        1 材料
            1.1 毒株/菌株/病料组织
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 引物设计与合成
            2.2 核酸DNA的提取
                2.2.1 病毒DNA的提取
                2.2.2 细菌核酸的提取
                2.2.3 组织DNA的提取
            2.3 DEV gN基因PCR扩增检测DVE的建立及优化
                2.3.1 DEV gN基因PCR扩增检测DVE的建立
                2.3.2 DEV gN基因PCR方法的特异性检验
                2.3.3 DEV gN基因PCR方法的灵敏性检验
            2.4 DEV gN基因PCR方法的检测病料组织
        3 结果
            3.1 DEV gN基因的PCR扩增结果
            3.2 PCR反应的特异性
            3.3 PCR反应的灵敏性检测
            3.4 病料组织的PCR检测
        4 讨论
第三部分 结论
参考文献
附录
    1 DEV gN基因的测序图谱
    2 DEV gM基因的测序图谱
致谢
在攻读硕士研究生期间已撰写论文



本文编号：4015782