鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC1和EtMIC2蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

发布时间：2024-12-26 02:47

　　柔嫩艾美耳球虫是七种鸡球虫中致病力最强的虫种之一，寄生于盲肠中，危害十分严重。虫体顶复合器中含有多种具有分泌功能的细胞器。其中，微线细胞器分泌的EtMIC1和EtMIC2蛋白在虫体粘附、入侵宿主细胞时起重要作用。目前研究表明EtMIC1、EtMIC2蛋白具有较好的免疫保护力，相关报道称EtMIC1、EtMIC2蛋白在球虫发育阶段的早期表达，但在其内生性发育的后期是否表达目前尚无报道。为了研究微线蛋白EtMIC1、EtMIC2在球虫整个内生性发育阶段表达的动态变化，本研究进行了以下工作： 1.单克隆抗体的制备 克隆了EtMIC1、EtMIC2基因，利用原核表达的EtMIC1、EtMIC2蛋白和本实验室保存的真核蛋白EtMIC1、EtMIC2免疫BALB/c小鼠。免疫的BALB/c小鼠抗体效价达到单克隆抗体制备的标准后，经细胞融合、间接ELISA筛选、两次亚克隆获得稳定分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。扩大培养收集细胞培养上清离心后作为单克隆抗体。结果得到了3组单克隆抗体。抗EtMIC1原核蛋白的单克隆抗体：1-H2；抗EtMIC1真核蛋白的单克隆抗体：1-A1、1-C4；抗EtMIC...

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中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 鸡球虫病的危害
    1.2 鸡球虫病原特性
    1.3 球虫的免疫原性
    1.4 柔嫩艾美耳球虫微线及微线蛋白
    1.5 柔嫩艾美尔球虫 EtMIC-1 和 EtMIC-2 研究进展
    1.6 柔嫩艾美耳球虫内生性发育不同阶段的划分
    1.7 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 虫种及细胞
        2.1.2 试验动物
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 质粒及受体菌
        2.1.5 主要设备及仪器
    2.2 方法
        2.2.1 主要试剂配制
        2.2.2 EtMIC1 和 EtMIC2 的克隆构建与原核表达
        2.2.3 EtMic1 和 EtMic2 重组蛋白的表达和纯化
        2.2.4 EtMic1 和 EtMic2 蛋白单克隆抗体的制备
        2.2.5 EtMic1 和 EtMic2 蛋白单克隆抗体的鉴定与应用
3 结果与分析
    3.1 EtMIC1 和 EtMIC2 基因的克隆
        3.1.1 EtMIC1 和 EtMIC2 基因片段的 PCR 扩增
        3.1.2 pET-30a (+)-EtMIC1 和 pET-30a (+)-EtMIC2 质粒转化 top10 后菌落 PCR 结果
        3.1.3 重组质粒酶切鉴定结果
    3.2 EtMIC1 和 EtMIC2 基因的表达与蛋白纯化
        3.2.1 EtMIC1 和 EtMIC2 基因的表达与蛋白纯化
        3.2.2 原核表达 EtMIC1 和 EtMIC2 蛋白的浓度测定
    3.3 EtMIC1 和 EtMIC2 蛋白单克隆抗体的制备
        3.3.1 小鼠血清抗体效价的测定
        3.3.2 杂交瘤细胞的筛选
    3.4 单克隆抗体的鉴定
        3.4.1 单克隆抗体效价的测定
        3.4.2 单克隆抗体的亚型鉴定
        3.4.3 单克隆抗体的特异性鉴定
    3.5 EtMIC1 和 EtMIC2 蛋白在球虫内生性发育阶段表达的动态变化
        3.5.1 单抗检测
        3.5.2 Western blot 检测
4 讨论
5 结论
6 参考文献
7 致谢
8 硕士期间论文发表情况



本文编号：4020409