H9N2 AIV流行株全基因组序列分析及鸡α干扰素与白介素18共表达产物的抗病毒作用研究
发布时间：2025-02-08 19:53
H9N2亚型禽流感病毒的广泛流行与频繁的变异重组，不但对养殖行业造成了重大的经济损失，而且已经威胁到了人类身体健康与生命安全。在1994年，我国从广东地区分离得到第一株H9N2亚型禽流感病毒，此后，H9N2亚型禽流感病毒迅速向临近省份蔓延。本研究在山东地区开展了H9N2亚型禽流感分子流行病学调查工作并研究了鸡干扰素α和白介素18对H9N2亚型禽流感病毒的抗病毒作用。 本研究对2012年实验室分离鉴定的3株鸡源H9N2亚型禽流感进行生物学特性研究。3株病毒在SPF鸡胚上增值一代后，其HA效价在2～7～2～9之间，EID50在10-7.75/0.1mL～10-8.5/0.1mL之间，TCID50在10-8.00/0.1mL10-8.50/0.1mL之间。根据GenBank公布的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的全基因序列设计引物，并进行RT-PCR扩增，PCR产物送测序公司测序，完成3株山东地方分离株CK/SD/SG/2012、CK/SD/JN/2012、C...
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
Abstract
前言
1.1 禽流感的研究概述
1.1.1 禽流感病毒的组成和复制
1.1.2 血凝素 HA 的功能
1.1.2.1 HA 的裂解与流感致病性的关系
1.1.2.2 受体结合与释放的特异性
1.1.3 神经氨酸酶
1.1.4 内部基因的功能
1.1.4.1 聚合酶蛋白
1.1.4.2 核蛋白
1.1.4.3 基质蛋白
1.1.4.4 非结构蛋白
1.1.5 H9N2 亚型低致病性禽流感的流行现状
1.2 细胞因子概述
1.2.1 干扰素的研究概述
1.2.2 干扰素的命名及分类
1.2.3 干扰素的基本特性
1.2.4 干扰素的生物学活性
1.3 白介素 18 的研究概述
1.3.1 白介素18的生物学活性
1.4 细胞因子的联合应用
1.5 细胞因子用于预防与治疗的疾病潜力
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 毒株和质粒
2.1.2 细胞、受体菌与细胞培养基
2.1.3 引物
2.1.4 主要试剂
2.1.5 培养基与主要试剂的配制方法
2.1.5.1 各种培养基的配置
2.1.5.2 琼脂糖凝胶及电泳溶液
2.1.5.3 细胞培养试剂及 SDS-PAGE 试剂的配制
2.1.6 主要仪器
2.1.7 SPF 鸡胚
2.1.8 分子生物学分析软件
2.2 方法
2.2.1 鸡源 H9N2 亚型禽流感病毒株的分离鉴定与纯化
2.2.1.1 样品采集
2.2.1.2 病毒分离
2.2.1.3 病毒在 MDCK 细胞上的适应和增殖
2.2.1.4 病毒的纯化
2.2.2 H9N2 亚型禽流感分离株的生物学特性
2.2.2.1 病毒在 SPF 鸡胚中增殖的效价
2.2.2.2 组织半数感染量的测定
2.2.2.3 鸡胚半数感染量的测定
2.2.3 H9N2 亚型禽流感的序列测定及系统进化分析
2.2.3.1 病毒 RNA 的提取
2.2.3.2 反转录合成 cDNA
2.2.3.3 PCR 扩增各个基因片段
2.2.3.4 PCR 产物鉴定与序列测序
2.2.3.5 序列分析、核酸同源性比较、与进化树绘制
2.2.4 鸡干扰素α与白介素 18 共表达转移载体的构建
2.2.4.1 信号肽引物设计
2.2.4.2 鸡干扰素α与白介素 18 的 PCR 扩增与克隆
2.2.4.3 鸡干扰素α和白介素 18 基因的回收
2.2.4.4 共表达转移载体的构建
2.2.4.5 转移载体 HBM-CIFN-α&CIL-18 的质粒小提
2.2.4.6 DH10Bac 感受态细胞的制备
2.2.4.7 重组质粒 Bacmid 的构建
2.2.4.8 重组质粒 Bacmid 的提取与鉴定
2.2.5 重组 Bacmid 转染 sf9 昆虫细胞及收获重组杆状病毒
2.2.5.1 重组 Bacmid 转染 sf9 昆虫细胞
2.2.5.2 重组杆状病毒的 DNA 的提取与 PCR 鉴定
2.2.5.3 间接免疫荧光检测干扰素α和白介素 18 的共表达
2.2.5.4 SDS-PAGE 和 Western blot 检测鸡干扰素α和白介素 18 的共表达
2.2.5.5 鸡干扰素α和白介素 18 共表达产物在 MDCK 细胞上对 H9N2 禽流感病毒的抑制作用
3 结果与分析
3.1.1 对于本实验室 2012 年送检病料统计结果
3.1.2 H9N2 亚型禽流感病毒的分离与纯化
3.1.3 H9N2 亚型禽流感病毒的生物学特性
3.1.4 H9N2 亚型禽流感毒株的全基因测序与系统进化分析
3.1.5 基因概况和系统进化分析
3.1.5.1 HA 基因系统进化分析
3.1.5.2 NA 基因系统进化分析
3.1.5.3 M 基因系统进化分析
3.1.5.4 NS 基因系统进化分析
3.1.5.5 PB2 基因系统进化分析
3.1.5.6 PB1 基因系统进化分析
3.1.5.7 PA 基因系统进化分析
3.1.5.8 NP 基因系统进化分析
3.1.5.9 全基因组分析
3.2.1 鸡干扰素α及白介素 18 融合蜂素信号肽成熟蛋白的扩增
3.2.2 共表达载体的酶切鉴定及重组杆状病毒 PCR 结果
3.3.1 间接免疫荧光检测鸡干扰素α和白介素 18 的共表达
3.3.2 SDS-PAGE 和 Western blot 检测鸡干扰素α和白介素 18 的表达
3.3.3 鸡干扰素α和白介素 18 对 H9N2 亚型禽流感病毒的抗病毒作用
4 讨论
4.1 H9N2 禽流感分离株的基本生物学特性及基因序列分析
4.2 干扰素α与白介素 18 共表达及对 H9N2 亚型禽流感病毒的抗病毒作用
5 结论
参考文献
致谢
作者简介及论文发表情况
本文编号：4031898
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【学位级别】：硕士
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Abstract
前言
1.1 禽流感的研究概述
1.1.1 禽流感病毒的组成和复制
1.1.2 血凝素 HA 的功能
1.1.2.1 HA 的裂解与流感致病性的关系
1.1.2.2 受体结合与释放的特异性
1.1.3 神经氨酸酶
1.1.4 内部基因的功能
1.1.4.1 聚合酶蛋白
1.1.4.2 核蛋白
1.1.4.3 基质蛋白
1.1.4.4 非结构蛋白
1.1.5 H9N2 亚型低致病性禽流感的流行现状
1.2 细胞因子概述
1.2.1 干扰素的研究概述
1.2.2 干扰素的命名及分类
1.2.3 干扰素的基本特性
1.2.4 干扰素的生物学活性
1.3 白介素 18 的研究概述
1.3.1 白介素18的生物学活性
1.4 细胞因子的联合应用
1.5 细胞因子用于预防与治疗的疾病潜力
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 毒株和质粒
2.1.2 细胞、受体菌与细胞培养基
2.1.3 引物
2.1.4 主要试剂
2.1.5 培养基与主要试剂的配制方法
2.1.5.1 各种培养基的配置
2.1.5.2 琼脂糖凝胶及电泳溶液
2.1.5.3 细胞培养试剂及 SDS-PAGE 试剂的配制
2.1.6 主要仪器
2.1.7 SPF 鸡胚
2.1.8 分子生物学分析软件
2.2 方法
2.2.1 鸡源 H9N2 亚型禽流感病毒株的分离鉴定与纯化
2.2.1.1 样品采集
2.2.1.2 病毒分离
2.2.1.3 病毒在 MDCK 细胞上的适应和增殖
2.2.1.4 病毒的纯化
2.2.2 H9N2 亚型禽流感分离株的生物学特性
2.2.2.1 病毒在 SPF 鸡胚中增殖的效价
2.2.2.2 组织半数感染量的测定
2.2.2.3 鸡胚半数感染量的测定
2.2.3 H9N2 亚型禽流感的序列测定及系统进化分析
2.2.3.1 病毒 RNA 的提取
2.2.3.2 反转录合成 cDNA
2.2.3.3 PCR 扩增各个基因片段
2.2.3.4 PCR 产物鉴定与序列测序
2.2.3.5 序列分析、核酸同源性比较、与进化树绘制
2.2.4 鸡干扰素α与白介素 18 共表达转移载体的构建
2.2.4.1 信号肽引物设计
2.2.4.2 鸡干扰素α与白介素 18 的 PCR 扩增与克隆
2.2.4.3 鸡干扰素α和白介素 18 基因的回收
2.2.4.4 共表达转移载体的构建
2.2.4.5 转移载体 HBM-CIFN-α&CIL-18 的质粒小提
2.2.4.6 DH10Bac 感受态细胞的制备
2.2.4.7 重组质粒 Bacmid 的构建
2.2.4.8 重组质粒 Bacmid 的提取与鉴定
2.2.5 重组 Bacmid 转染 sf9 昆虫细胞及收获重组杆状病毒
2.2.5.1 重组 Bacmid 转染 sf9 昆虫细胞
2.2.5.2 重组杆状病毒的 DNA 的提取与 PCR 鉴定
2.2.5.3 间接免疫荧光检测干扰素α和白介素 18 的共表达
2.2.5.4 SDS-PAGE 和 Western blot 检测鸡干扰素α和白介素 18 的共表达
2.2.5.5 鸡干扰素α和白介素 18 共表达产物在 MDCK 细胞上对 H9N2 禽流感病毒的抑制作用
3 结果与分析
3.1.1 对于本实验室 2012 年送检病料统计结果
3.1.2 H9N2 亚型禽流感病毒的分离与纯化
3.1.3 H9N2 亚型禽流感病毒的生物学特性
3.1.4 H9N2 亚型禽流感毒株的全基因测序与系统进化分析
3.1.5 基因概况和系统进化分析
3.1.5.1 HA 基因系统进化分析
3.1.5.2 NA 基因系统进化分析
3.1.5.3 M 基因系统进化分析
3.1.5.4 NS 基因系统进化分析
3.1.5.5 PB2 基因系统进化分析
3.1.5.6 PB1 基因系统进化分析
3.1.5.7 PA 基因系统进化分析
3.1.5.8 NP 基因系统进化分析
3.1.5.9 全基因组分析
3.2.1 鸡干扰素α及白介素 18 融合蜂素信号肽成熟蛋白的扩增
3.2.2 共表达载体的酶切鉴定及重组杆状病毒 PCR 结果
3.3.1 间接免疫荧光检测鸡干扰素α和白介素 18 的共表达
3.3.2 SDS-PAGE 和 Western blot 检测鸡干扰素α和白介素 18 的表达
3.3.3 鸡干扰素α和白介素 18 对 H9N2 亚型禽流感病毒的抗病毒作用
4 讨论
4.1 H9N2 禽流感分离株的基本生物学特性及基因序列分析
4.2 干扰素α与白介素 18 共表达及对 H9N2 亚型禽流感病毒的抗病毒作用
5 结论
参考文献
致谢
作者简介及论文发表情况
本文编号：4031898
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/4031898.html
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