H5N1型禽流感病毒HA基因重组杆状病毒的构建及其免疫效果的研究
发布时间：2025-02-11 13:51
H5N1 亚型高致病禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)是一种急性、高度接触性的禽类传染病,该病是由A型流感病毒引起的。血凝素HA作为禽流感病毒的主要保护性抗原,在其抗原性和致病性中发挥重要作用。启动子是制约重组杆状病毒在细胞中表达的主要因素之一,强启动子的使用能够增强外源基因的表达效率。CMV启动子和WSSV ie1启动子都是公认的强启动子,在哺乳动物细胞和昆虫细胞中各有优势,能够高效启动外源基因的表达。本课题将H5N1型禽流感病毒HA基因分别克隆到由CMV启动和WSSV ie1启动的含有VSV-GED、WPRE、ITRs等调控元件的两组杆状病毒转移载体中,通过Bac-to-Bac系统获得重组Bacmid DNA;通过对Sf9昆虫细胞的转染,收获两组重组杆状病毒;利用重组杆状病毒进一步侵染鸡胚成纤维细胞,进行SDS-PAGE和Western blotting分析,比较HA基因在禽类细胞中的表达水平;将携带HA基因的重组杆状病毒直接作为疫苗进行鸡体免疫试验,将目的抗原基因高效地传递到家禽细胞中,使其有效地刺激机体产生特异性保护抗体和较强的...
【文章页数】：105 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
符号与缩略语
第1章 绪论
1.1 禽流感病毒概况
1.1.1 H5N1亚型禽流感的流行现状
1.1.2 AIV的形态
1.1.3 AIV基因编码的主要蛋白质
1.1.4 HA蛋白与AIV的致病性
1.1.5 AIV的防治
1.2 杆状病毒表达系统
1.2.1 杆状病毒表达系统的优越性
1.2.2 杆状病毒表达系统在禽流感疫苗中的应用
1.3 杆状病毒的基因修饰
1.3.1 选用合适的启动子
1.3.2 添加WPRE、ITRs等调控元件
1.4 本研究的目的和意义
1.5 本研究的实验技术路线
1.5.1 重组杆状病毒转移载体的构建策略
1.5.2 重组杆状病毒的扩增和外源基因的表达
1.5.3 重组杆状病毒的鸡体免疫试验
1.6 课题资助名称
第2章 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 供试材料
2.1.2 扩增引物
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 主要分子生物学及生化试剂
2.1.5 主要缓冲液及试剂配制
2.2 试验方法
2.2.1 重组转移载体的构建
2.2.2 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid DNA的获得
2.2.3 重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞
2.2.4 重组杆状病毒的扩增及滴度测定
2.2.5 重组杆状病毒在鸡胚成纤维细胞中表达
2.2.6 重组蛋白的SDS-PAGE检测和Western-blotting鉴定
2.2.7 间接免疫荧光检测VSVG蛋白
2.2.8 重组杆状病毒的鸡体免疫试验
第3章 结果
3.1 重组转移载体的构建
3.1.1 目的片段HA的克隆与鉴定
3.1.2 pS-HA系列重组转移载体的构建
3.1.3 pA-HA系列重组转移载体的构建
3.2 重组杆状病毒穿梭载体的鉴定
3.2.1 重组穿梭转移载体Bacmid-S-HA系列的鉴定
3.2.2 重组穿梭转移载体Bacmid-A-HA系列的鉴定
3.3 重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞
3.3.1 Sf9昆虫细胞生长曲线的绘制
3.3.2 重组杆状病毒感染Sf9细胞后的病变形态
3.3.3 P1代重组杆状病毒的收获
3.4 重组杆状病毒的扩增及滴度测定
3.4.1 重组杆状病毒的PCR鉴定
3.4.2 重组杆状病毒的滴度测定
3.5 重组杆状病毒介导目的基因在鸡胚成纤维细胞中的表达
3.5.1 鸡胚成纤维细胞的形态
3.5.2 HA蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting鉴定
3.5.3 重组蛋白的Western blotting分析
3.6 间接免疫荧光检测结果
3.7 重组杆状病毒的鸡体免疫试验
3.7.1 鸡外周血淋巴细胞增殖试验
3.7.2 鸡血清中IgG抗体水平的检测
3.7.3 鸡血清中IL-4含量的检测
3.7.4 鸡血清中IL-2含量的检测
3.7.5 鸡血清中IFN-γ含量的检测
第4章 讨论
4.1 课题背景
4.2 不同启动子对目的蛋白HA表达的影响
4.3 不同调控元件对目的蛋白表达的影响
4.4 不同启动子的重组杆状病毒疫苗的免疫原性的影响
4.5 不同调控元件对重组杆状病毒疫苗免疫原性的影响
4.6 免疫程序的选择
第5章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
本文编号：4033361
【文章页数】：105 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
符号与缩略语
第1章 绪论
1.1 禽流感病毒概况
1.1.1 H5N1亚型禽流感的流行现状
1.1.2 AIV的形态
1.1.3 AIV基因编码的主要蛋白质
1.1.4 HA蛋白与AIV的致病性
1.1.5 AIV的防治
1.2 杆状病毒表达系统
1.2.1 杆状病毒表达系统的优越性
1.2.2 杆状病毒表达系统在禽流感疫苗中的应用
1.3 杆状病毒的基因修饰
1.3.1 选用合适的启动子
1.3.2 添加WPRE、ITRs等调控元件
1.4 本研究的目的和意义
1.5 本研究的实验技术路线
1.5.1 重组杆状病毒转移载体的构建策略
1.5.2 重组杆状病毒的扩增和外源基因的表达
1.5.3 重组杆状病毒的鸡体免疫试验
1.6 课题资助名称
第2章 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 供试材料
2.1.2 扩增引物
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 主要分子生物学及生化试剂
2.1.5 主要缓冲液及试剂配制
2.2 试验方法
2.2.1 重组转移载体的构建
2.2.2 重组杆状病毒穿梭载体Bacmid DNA的获得
2.2.3 重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞
2.2.4 重组杆状病毒的扩增及滴度测定
2.2.5 重组杆状病毒在鸡胚成纤维细胞中表达
2.2.6 重组蛋白的SDS-PAGE检测和Western-blotting鉴定
2.2.7 间接免疫荧光检测VSVG蛋白
2.2.8 重组杆状病毒的鸡体免疫试验
第3章 结果
3.1 重组转移载体的构建
3.1.1 目的片段HA的克隆与鉴定
3.1.2 pS-HA系列重组转移载体的构建
3.1.3 pA-HA系列重组转移载体的构建
3.2 重组杆状病毒穿梭载体的鉴定
3.2.1 重组穿梭转移载体Bacmid-S-HA系列的鉴定
3.2.2 重组穿梭转移载体Bacmid-A-HA系列的鉴定
3.3 重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞
3.3.1 Sf9昆虫细胞生长曲线的绘制
3.3.2 重组杆状病毒感染Sf9细胞后的病变形态
3.3.3 P1代重组杆状病毒的收获
3.4 重组杆状病毒的扩增及滴度测定
3.4.1 重组杆状病毒的PCR鉴定
3.4.2 重组杆状病毒的滴度测定
3.5 重组杆状病毒介导目的基因在鸡胚成纤维细胞中的表达
3.5.1 鸡胚成纤维细胞的形态
3.5.2 HA蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting鉴定
3.5.3 重组蛋白的Western blotting分析
3.6 间接免疫荧光检测结果
3.7 重组杆状病毒的鸡体免疫试验
3.7.1 鸡外周血淋巴细胞增殖试验
3.7.2 鸡血清中IgG抗体水平的检测
3.7.3 鸡血清中IL-4含量的检测
3.7.4 鸡血清中IL-2含量的检测
3.7.5 鸡血清中IFN-γ含量的检测
第4章 讨论
4.1 课题背景
4.2 不同启动子对目的蛋白HA表达的影响
4.3 不同调控元件对目的蛋白表达的影响
4.4 不同启动子的重组杆状病毒疫苗的免疫原性的影响
4.5 不同调控元件对重组杆状病毒疫苗免疫原性的影响
4.6 免疫程序的选择
第5章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
本文编号：4033361
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/4033361.html
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